应用McAb-ELISA检测人血清纤维蛋白(原)降解产物碎片E

应用单克隆抗体建立ELISA双抗体夹心法,用于临床检测人血清纤维蛋白(原)降解产物碎片E、敏感性好、特异性强、线性定量范围大。单克隆抗体与常规多抗比较,两者的阳性检出率一致。     

高效液相色谱外标法测定人纤维蛋白原中盐酸精氨酸含量

目的建立高效液相色谱外标法检测人纤维蛋白原中盐酸精氨酸含量,并对方法进行验证及初步应用。方法色谱柱:氨基键合柱(250 mm×4. 6 mm×5μm);流动相:乙腈-磷酸盐缓冲液(1∶1);流速:1. 0 m L/min;紫外检测波长:205 nm;柱温:40℃;进样量:20μL,采用面积外标法计算盐酸精氨酸含量,并验证方法的系统适应性、线性范围、重复性、稳定性、准确度及定量限(LOQ)。应用建立的方法测定3批人纤维蛋白原中盐酸精氨酸的含量,并与《中国药典》三部(2015版)规定方法进行比较。结果该方法色谱峰型单一,且无其他干扰,盐酸精氨酸与甘氨酸的分离度为10. 54;盐酸精氨酸浓度在0. 116 2～0. 536 1 mg/mL范围内,与峰面积呈良好的线性关系,线性方程为:y=7 476. 695 68 x+72. 418 815,相关系数(R)为0. 999 24;同一人纤维蛋白原样品重复6次检测盐酸精氨酸含量的相对标准偏差(relativestandard deviation,RSD)为0. 22%;人纤维蛋白原样品于4℃放置0、4、8、12、16、20 h,盐酸精氨酸检测结果 RSD为0. 57%;高、中、低3个浓度加样样品检测结果平均回收率为(101. 36±1. 53)%,RSD为1. 51%;LOQ为0. 581μg/mL。两种方法检测3批样品盐酸精氨酸含量为25. 9～26. 3 g/L,两者差异无统计学意义(P 0. 05)。结论高效液相色谱外标法操作简便,重复性、稳定性、准确度良好,可用于人纤维蛋白原中盐酸精氨酸含量的测定。     

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。     

抗轮状病毒LLR株G10血清型特异性单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗轮状病毒(RV)LLR株G10血清型特异性单克隆抗体,并鉴定其特性。方法以纯化的RVLLR株(血清型为G10)为抗原免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术筛选分泌G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。采用层析法纯化单抗,常规免疫学方法鉴定单抗的特性。结果经筛选获得5G5、1H1和7F6共3株可稳定分泌高效价且具有G10血清型特异性单抗的杂交瘤细胞株。3株细胞分泌的单抗分别为IgG2a/κ、IgG2a/κ和IgG1/κ型;腹水效价均可达1.024×106;分别识别两个抗原位点;相对亲和力依次为1H1﹥7F6﹥5G5;5G5和1H1(细胞上清)均与G1～G4和G6血清型RV抗原无交叉反应;3株杂交瘤细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约为34000的VP7蛋白,且均有不同程度的中和活性。结论已成功制备了抗RVLLR株G10血清型特异性单抗,该单抗可用于G10血清型RV的分型检测或LLR毒株的鉴别。     

四价脑膜炎球菌多糖单克隆抗体的制备及其应用

目的制备四价脑膜炎球菌多糖的单克隆抗体,并将其应用于速率散射比浊试验。方法分别用A、C、W135、Y群脑膜炎球菌多糖(meningococcal polysaccharides of group A,C,W135 and Y,分别简写为GAMP、GCMP、GWMP、GYMP)与白喉毒素无毒变异体CRM197结合物(GAMP-CRM197、GCMP-CRM197、GWMP-CRM197、GYMP-CRM197)免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,采用间接ELISA法筛选杂交瘤细胞株,对阳性细胞株进行特异性检测及纯化抗体效价检测。每种血清群选1株单抗,用于速率散射比浊试验定标。结果分别获得稳定分泌抗GAMP、GCMP、GWMP、GYMP细胞株20、18、9和13株,其中抗GAMP特异性单抗5株,抗GCMP特异性单抗5株,抗GWMP特异性单抗3株,抗GYMP特异性单抗5株,均与CRM197及其他3个血清群多糖无交叉反应。抗GAMP纯化抗体效价均>1∶4 000 000,抗GCMP纯化抗体效价均>1∶200 000,抗GWMP纯化抗体效价均可达1∶40 000,抗GYMP纯化抗体效价均可达1∶40 000。抗GAMP单抗6B7和抗GCMP单抗2H4在标准品浓度2~10μg/ml范围内,可用于速率散射比浊试验定标,R2分别为0.990 9和0.991 9;抗GWMP单抗5F1在标准品浓度4.33~21.7μg/ml范围内,可用于速率散射比浊试验定标,R2为0.851 8;抗GYMP单抗7C6在标准品浓度1~8μg/ml范围内,可用于速率散射比浊试验定标,R2为0.998 7。结论成功制备了四价脑膜炎球菌多糖特异性单抗,并应用于速率散射比浊试验。     

不同浓度抗菌素对血浆纤维蛋白原的影响

目的研究4种常用抗菌素的浓度对血浆纤维蛋白原的影响。方法采用凝固法,以加入抗菌素后血浆中纤维蛋白原的凝固时间为指标,观察不同浓度的头孢哌酮钠、氯霉素、乳酸环丙沙星和硫酸庆大霉素对血浆纤维蛋白原的影响。结果随着氯霉素、硫酸庆大霉素和乳酸环丙沙星浓度的降低,血浆中纤维蛋白原的凝固时间延长;而随着头孢哌酮钠浓度的降低,凝固时间反而缩短。随着氯霉素、硫酸庆大霉素、乳酸环丙沙星浓度降低,血浆中纤维蛋白检出率升高;随着头孢哌酮钠浓度降低,血浆中纤维蛋白原检出率亦降低。结论头孢哌酮钠、氯霉素、乳酸环丙沙星、硫酸庆大霉素等抗菌素及其浓度变化对血浆中纤维蛋白原的凝固时间和检出率有显著影响。     

载脂蛋白B_(100)杂交瘤细胞株的建立及单抗免疫学特性的研究

采用密度梯度离心法从新鲜人血浆中快速分离提取高纯度的LDL,以此免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交技术建立了11株稳定分泌抗ApoB_(100)的杂交瘤细胞株,所分泌的11种单抗除L_2/169为IgG2b外,其余均为IgG_1。腹水抗体效价为10~(-5)～10~(-8)。应用ELISA间接法证明,11种单抗均与ApoB_(100)(本研究制备及Sigma产品)产生强阳性反应,部分单抗与VLDL产生反应,而均不与其它包括脂蛋白、载脂蛋白在内的血浆蛋白产生反应。应用免疫印迹法证明,各种McAb识别的靶抗原分子量为525KD。对其中4种McAb的抗原表位特异性也进行了研究,通过相加试验及双抗体竞争试验均证实,4种单抗可分为2组,各识别不同的抗原决定簇。     

鸡传染性支气管炎病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)M蛋白单克隆抗体,并进行鉴定。方法利用IBV Sczy3株免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选杂交瘤细胞,强阳性孔经有限稀释法亚克隆,制备抗IBV M蛋白单克隆抗体。对制备的单抗进行单抗亚型、腹水ELISA效价、特异性、交叉反应性鉴定及Western blot分析。结果获得2株能稳定分泌抗IBV M蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2C10和7H6,单抗亚型分别为IgM和IgG1;腹水ELISA效价分别为1∶25 600和1∶12 800;2株单抗均只与IBV发生特异性反应,而与新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)、禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H9亚型、AIV H5抗原和鸡传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)均不反应;2株单抗与5种基因型的其他10株IBV均有良好的反应性。结论制备出2株针对IBV M蛋白的单抗,为今后更深入地研究该蛋白的分子生物学功能、抗原表位的鉴定及抗原捕获ELISA方法的建立等提供了有力的工具。     

AgBr晶体的潜影衰退与明胶成分的关系

<正> 5.明胶碎片表1指出三种浓度的明胶碎片,特别是分子量最低的明胶碎片,也与母体明胶一样能够稳定潜影。实验中稳定材料都于曝光前加到乳剂中。表2数据表明,明胶碎片的抗衰退性与它们在曝光前或曝光后加入无关。 6.含有18肽的明胶碎片实验发现,明胶碎片具有与母体明胶同样良好的稳定潜影性能,因而用α明胶重新制备更短的明胶碎片,即含18个氨基酸的短肽,用它与明胶碎片B和C进行比较。发现具有18肽的明胶碎片的稳定性至少能与较大的明胶碎片或母体明胶相似(见表3)。 7.氨基酸类测试各种氨基酸的稳定效应用β—丙氨酸(Ⅰ)、甘氨酸(Ⅱ)、L—脯氨酸(Ⅲ)、DL—色     

抗β-淀粉样蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定

目的建立抗β-淀粉样蛋白(Aβ)单克隆抗体杂交瘤细胞系,并鉴定Aβ单抗的免疫学特性,以便用于阿尔茨海默病(AD)的防治研究。方法用戊二醛法将半抗原Aβ1-42偶联于载体蛋白BSA,形成结合抗原BSA-Aβ。用常规腹腔注射法和微量足垫注射法分别免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术建立分泌Aβ单抗的细胞株,体内诱生腹水法制备Aβ单抗。硫酸铵盐析法提纯,常规免疫学法检测鉴定Aβ单抗的免疫学特性。结果筛选出A-B7、A-D11、A-E93株高特异性杂交瘤细胞株,亚型均为IgM型,单抗的ELISA间接效价分别为2×10-5、2×10-5和1×10-5。杂交瘤细胞染色体数目在80~90之间,纯化后单抗腹水蛋白回收率在20%左右。结论已成功建立了分泌抗Aβ单抗的细胞系,并制备出半抗原Aβ的单抗,可用于AD的进一步研究。     

应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。     

抗猪呼吸与生殖综合征病毒Nsp9蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗猪呼吸与生殖综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)Nsp9蛋白单克隆抗体,并进行初步鉴定。方法用纯化的重组Nsp9蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗PRRSV Nsp9蛋白单克隆抗体,采用Western blot和间接免疫荧光试验分析单抗的特异性;使用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗的亚类;将杂交瘤细胞分别保存1、2、3、4个月后复苏,采用间接ELISA法检测细胞分泌抗体的能力。结果共获得3株可稳定分泌特异性单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为2D6、3C11和4E6,其细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶6 400、1∶3 200和1∶1 600,腹水的ELISA效价分别为1∶640 000、1∶512 000和1∶256 000。3株单抗均可与Nsp9蛋白和PRRSV特异性结合;2D6和3C11株单抗的Ig亚型为IgG1,4E6株单抗为IgM亚类抗体;3株杂交瘤细胞保存4个月均能稳定分泌单抗。结论已制备抗PRRSVNsp9蛋白单克隆抗体,其特异性高,稳定性良好,为建立鉴别自然感染与注射疫苗感染PRRSV的诊断方法提供了材料。     

抗SARS冠状病毒单克隆抗体的制备和鉴定

目的建立能稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。方法用SARS-CoV灭活全病毒液免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术建立6株稳定分泌抗SARS-CoV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并进行全面鉴定。结果免疫双扩散证实1C6细胞株分泌的单抗为IgG2a亚类,其余5株细胞分泌的单抗为IgG1亚类;腹水效价均达到10-6以上;6株细胞分泌的单抗均不与麻疹病毒等其它5种呼吸道病毒发生交叉反应;Westernblot证实6株细胞分泌的单抗均识别相对分子质量约150000的S蛋白及其相对分子质量为120000的裂解片段;相加指数证实6株细胞分泌的单抗识别相关的抗原表位;用硫氰酸铵洗脱法比较了6株细胞分泌的单抗的相对亲和力大小,依次为1A4>4F6>1C6>1B10>2H2>1F3;中和试验证实单抗4F6和1F3具有中和活性,中和效价均为1∶10;杂交瘤细胞株连续培养3个月以上及冻存半年后复苏,细胞生长良好,效价稳定。结论已获得抗SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断及进一步研究奠定了基础。     

人肝癌特异性γ-GT Ⅱ单克隆抗体的研究

利用杂交瘤技术获5株分泌鼠抗人肝癌特异性γ－GTⅡ单克隆抗体细胞株，经核型分析，证明所建杂交瘤细胞系融合细胞。对其分泌的MCAb进行生物学特性鉴定，各McAb滴度不一，有的高达10－9，有的低至10－2左右。5种McAb均为IgG型，只与纯化的γ－GTⅡ起反应。有2种McAb有相同的位点，另外3种有不同的位点。     

抗霍乱弧菌O1群单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的制备抗霍乱弧菌O1群特异性单克隆抗体(McAb),并进行鉴定。方法以福尔马林灭活的O1群霍乱弧菌免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术建立分泌抗O1群霍乱弧菌McAb的杂交瘤细胞株。对配对较好的6个细胞株分泌的McAb进行腹水效价、免疫球蛋白类及亚类、抗体亲和常数测定及凝集试验和稳定性试验。与细菌培养法对比检测208份临床标本。结果6个细胞株分泌的McAb腹水效价均为105,均为IgM;抗体亲和常数为1.84×105～5.38×107;且均与O1群霍乱弧菌菌株发生凝集反应,与霍乱弧菌O139群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌O157∶H7、副溶血弧菌、麦弧菌、河弧菌、结肠炎耶尔森菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及各型副伤寒杆菌均不发生凝集反应。6个分泌McAb的细胞株连续培养15周,经液氮冻存12个月后复苏,仍能稳定分泌抗体;与细菌培养法对比检测208份临床标本,特异性和灵敏度均达100%。结论制备的McAb具有较高的特异性,有可能用于开发霍乱弧菌O1群的检测试剂。     

抗 A、B 和 C 群脑膜炎球菌多糖单克隆抗体的制备及鉴定

10株抗 A、B 和 C 群脑膜炎球菌多糖 McAb,经 PHA、PHAI、ELISA 和试管凝集试验测出较高的群特异性抗体滴度。经中国药品生物制品检定所选用12个群脑膜炎球菌国家标准菌株和地方菌株以及其它奈瑟氏菌株进行玻片凝集和试管凝集检定。结果显示 McAb 滴度高、特异性强,用于分群诊断取得满意的结果。10株 McAb 均属小鼠 IgM 类。     

抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段单克隆抗体的制备

目的制备抗肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞外段(sTRAIL)的单克隆抗体。方法用重组sTRAIL免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0细胞融合,捕获ELISA筛选阳性克隆,制备腹水抗体。间接ELISA测定单抗效价,并进行单抗亚类、特异性鉴定及杂交瘤细胞染色体和单抗识别位点分析。将杂交瘤细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后,检测细胞培养上清的效价。结果3株杂交瘤细胞分泌的单抗均为IgG1型,腹水单抗效价均高于10-6,杂交瘤细胞染色体数介于94～98条之间,均识别sTRAIL分子上线性表位。细胞体外连续培养3个月及冻存6个月后的上清效价保持稳定。结论已成功制备了3株可稳定分泌抗sTRAIL单克隆抗体的杂交瘤细胞,为TRAIL的定性定量检测及组织表达分析奠定了基础。     

单纯疱疹病毒单克隆抗体的制备及鉴定

目的 制备单纯疱疹病毒的单克隆抗体。方法 用纯化的单纯疱疹病毒（HSV）抗原免疫雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合。经ELISA间接法筛选和克隆化培养,获得两株分泌抗单纯疱疹病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞,纯化其腹水获得单抗,检测该单抗的特异性。结果 这两种单抗与其他相关的病毒抗原无交叉反应,Western blot表明单抗均识别单纯疱疹病毒中相对分子质量50000的蛋白。结论 该单抗为单纯疱疹病毒的单克隆抗体。     

抗重组人白细胞介素-12单克隆抗体的制备及初步应用

目的制备抗重组人白细胞介素-12(rhIL-12)单克隆抗体(McAb),并建立检测IL-12的双抗体夹心ELISA方法。方法以纯化的rhIL-12(p70)免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,建立双抗体夹心ELISA法,检测胃癌患者术前、术后血清IL-12水平的变化。结果筛选出3株稳定分泌抗rhIL-12的单抗杂交瘤细胞株,纯化后单抗纯度达95%以上。免疫球蛋白亚类2株为IgG1,1株为IgG2a,轻链属!型,相对亲和力依次为EM5>EM6>EV9。Western blot及ELISA交叉试验表明,单抗具有良好的特异性。建立的双抗体夹心ELISA方法检测rhIL-12的最低检出限为20pg/ml,线性范围为25～3200pg/ml。应用此法检测胃癌患者术前血清IL-12水平较正常对照组明显降低,术后10d明显升高。术后给予免疫增强型NE组IL-12水平较未给予组明显升高。结论制备的抗rhIL-12单克隆抗体,能够用于IL-12的体内外免疫学检测,为IL-12的研究、检测及临床应用奠定了基础。     

荧光标记CD3/CD4/CD8单克隆抗体的质量控制

目的对荧光素标记的CD3、CD4和CD8单克隆抗体进行质量控制。方法采用多参数的流式细胞分析技术,对单色、多色荧光标记抗体的偶联率及偶联效果进行分析与评价,并进行稳定性试验。结果荧光标记的单克隆抗体特异性保持完好;单色标记的抗体荧光强度均比进口对照低一个数量级;FITC-CD3/PE-CD4平均荧光强度与进口对照相差较大,FITC-CD3/PE-CD8和FITC-CD4/PE-CD8平均荧光强度与进口对照相差较小;FITC标记产物的F/P值控制在1～2之间;标记抗体于2～8℃放置18个月,稳定性良好。结论应用FITC、PE标记的CD3、CD4和CD8单克隆抗体可以采用流式细胞仪进行检测。