L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达

通过PCR获得黄色短杆菌ATCC14067基因组上编码L-亮氨酸合成途径中关键酶的基因.连接大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达质粒pDXW-8构建多种重组质粒,分别转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032考察对其发酵生产L-亮氨酸的影响.经摇瓶发酵实验显示:C.glutamicum ATCC13032发酵液中没有L-亮氨酸的积累而基因工程菌ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC中L-亮氨酸的产量达4.75g/L.     

敲除pknG提高谷氨酸棒杆菌L-谷氨酸和GABA产量

γ-氨基丁酸(GABA)具有多种生理功能,被广泛应用于食品、医药等行业。在谷氨酸棒杆菌ATCC13032中表达来自短乳杆菌的两个谷氨酸脱羧酶(GAD)编码基因gadB1、gadB2,可将其自身积累的L-谷氨酸有效转变成GABA。为了进一步提高GABA产量,首先在ATCC13032中敲除了丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PknG的编码基因pknG,以提高GABA的前体物质L-谷氨酸的供应,然后将GAD表达质粒pJYW-4-gad B1-gad B2转入pknG敲除菌株和ATCC13032中,构建出重组菌SNW203和SNW200,最后对两个重组菌进行上罐发酵。结果表明:相对于SNW200,菌株SNW203的L-谷氨酸和GABA产量都有所提高。发酵72 h后,GABA产量为(30.2±0.3)g/L,相对于SNW200提高了55.4%,L-谷氨酸和GABA的总摩尔浓度为0.3 mol/L,提高了36.4%。这说明敲除pknG能够促进重组谷氨酸棒杆菌的L-谷氨酸和GABA生物合成。     

解除硝酸盐呼吸和氮通量限制对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响

精氨酸广泛应用于食品、医药和工业领域中，其生产方式主要是微生物发酵法。钝齿棒状杆菌(Corynebacterium crenatum)是精氨酸生产的重要工程菌株。该文针对课题组前期构建的钝齿棒杆菌(CCM01)进行代谢改造，探究了arnR和cgl2482的敲除对钝齿棒杆菌产精氨酸的影响。采用无痕敲除方法构建工程菌株并对其进行摇瓶发酵，测定菌体生长量、L-精氨酸产量、葡萄糖消耗量考察菌株产L-精氨酸的影响。硝酸盐能提高钝齿棒杆菌在氧气不足时的生长率，并且arnR的敲除有助于L-精氨酸的生产，arnR敲除菌株CCM02较对照菌株产量提高了8.58%,且当硝酸盐浓度在1.5 mmol/L时对积累L-精氨酸最为有利，产量达到17.09 g/L;cgl2482的敲除有助于氮源流入精氨酸合成途径，其敲除菌株CCM03精氨酸产量达到了17.88 g,较对照提高了4.9%;最终在CCM03发酵中添加1 g/L的尿素、50 g/L的谷氨酸钠以及1.5 mmol/L的硝酸盐时，L-精氨酸产量达到22.25 g/L,较CCM01提高了46.8%。     

谷氨酸高产菌GDK-9的定向选育及其发酵过程研究

以天津短杆菌GDK6为出发菌株,通过原生质体紫外诱变、紫外诱变和硫酸二乙酯(DES)诱变定向选育L-谷氨酸生产菌。经摇管初筛、摇瓶复筛、遗传标记验证、单菌落分离和连续传代,最终筛选出1株L-谷氨酸高产菌GDK-9。该菌株在未优化条件下摇瓶发酵42h产L-谷氨酸79.2g/L。另外,试验结果证实GDK-9菌株的遗传标记和产酸能力十分稳定。在优化条件下,通过7L罐发酵32h,谷氨酸产量达131.5g/L,糖酸转化率达到62.2%。     

1dhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822 发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（Corynebactenum glutamicum） TCCC 11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△1dh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因1dhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的.结果表明,与出发菌株相比1dhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6％,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6％和5.5％,但生物量略有下降.本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考.     

敲除aceA和gogat及过表达gltA对谷氨酸棒状杆菌GKGD合成α-酮戊二酸的影响

α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)在生命活动中具有重要的作用,被广泛应用于食品、医药等领域。以α-KG生产菌谷氨酸棒状杆菌GKGD为出发菌株,敲除其异柠檬酸裂解酶编码基因ace A以增加异柠檬酸供应,获得GKGD-1,摇瓶发酵条件下其α-KG产量和转化率分别提高14.72%和9.76%;敲除谷氨酸合酶编码基因gogat以降低L-谷氨酸生成量,获得GKGD-2,其α-KG产量和转化率分别提高7.39%和5.43%,L-谷氨酸生成量降低52.87%;过表达柠檬酸合酶编码基因glt A以进一步增加前体物供应,获得GKGD-3,其α-KG产量提高35.9%;于7.5 L发酵罐经30 h发酵,GKGD-3α-KG产量达49.5 g/L,较出发菌株提高36.4%,L-谷氨酸生成量降低50%。敲除ace A和gogat并过表达glt A可显著提高α-KG产量并降低L-谷氨酸生成量。     

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) SNK118中表达NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高L-精氨酸(L-Arginine)和L-鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum) DSM 13864来源的NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Csgap C)。构建了产L-精氨酸的重组菌SNK118/p XMJ19-Csgap C,当摇瓶发酵70 h时产L-精氨酸11. 55 g/L,糖酸转化率0. 13 g/g,与对照菌SNK118/p XMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10. 2%。在L-鸟氨酸生产菌株SNK118Δarg FΔargR中重组表达Csgap C,重组菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19-Csgap C摇瓶发酵70 h产L-鸟氨酸27. 76 g/L,糖酸转化率0. 274 g/g,与对照菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19相比,L-鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20. 1%和15. 6%。结果表明,异源表达Csgap C有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸的水平。     

缬氨酸生产菌株的定向改造及发酵优化

缬氨酸是人体必需氨基酸之一,具有重要的生理生化作用。为进一步提高缬氨酸产量及优化发酵过程的温度控制,从谷氨酸棒杆菌细胞壁肽聚糖合成途径的2个关键基因murA(cgl0352)和murB(cgl0353)入手,从1株缬氨酸生产菌中敲除murA和murB基因构建出重组工程菌株C.glutamicum A301。摇瓶发酵结果显示,该菌株具有温度敏感性,在变温发酵的条件下,能从生长型状态转化为产酸型状态,促进缬氨酸的积累。在5 L发酵罐中采用分段控温策略发酵,即前15 h控温33℃,15 h之后提温至39℃,重组工程菌株的缬氨酸产量达到35.5 g/L,与全程33℃发酵相比提高了55.7%。研究为缬氨酸发酵过程温度控制提供了经验,同时对于谷氨酸棒杆菌的定向改造提供了一种思路。     

ldhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TCCC11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△ldh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因ldhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的。结果表明,与出发菌株相比ldhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6%,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6%和5.5%,但生物量略有下降。本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考。     

途径工程改造谷氨酸棒杆菌合成L-半胱氨酸

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸,广泛应用在医药、食品和化妆品等行业。该文以实验室保藏的一株高产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)A36为出发菌株,通过加强表达丝氨酸O-乙酰基转移酶(serine O-acetyltransferase, SAT)、O-乙酰基-L-丝氨酸巯基化酶-A和转运蛋白Bcr编码基因强化L-半胱氨酸合成和转运,敲除L-半胱氨酸降解途径关键酶弱化其降解,构建系列重组菌株,其中重组菌S-C-7的L-半胱氨酸产量最高,为286.7 mg/L。进一步通过优化硫源提高菌株S-C-7的L-半胱氨酸产量,结果表明,最佳硫源为硫代硫酸钠,当发酵24 h时添加12 g/L硫代硫酸钠,L-半胱氨酸的产量最高,为581.6 mg/L,较优化前提高1.0倍。最后,在5 L发酵罐对S-C-7进行发酵评价,L-半胱氨酸产量达到1.2 g/L,是目前文献报道谷氨酸棒杆菌产L-半胱氨酸的最高产量;为实现谷氨酸棒杆菌发酵生产L-半胱氨酸奠定了基础。     

高效合成L-高丝氨酸大肠杆菌基因工程菌株的构建

针对现有L-高丝氨酸生产菌株因营养缺陷需在发酵过程中添加L-苏氨酸等物质的问题,以大肠杆菌为底盘细胞,构建1株非营养缺陷型L-高丝氨酸高产菌株.首先通过下调thrB和thrC的转录弱化L-高丝氨酸的降解途径;并过表达thrA、ppc和pntAB以强化L-高丝氨酸合成代谢流、提高前体物以及辅酶供应;在此基础上过表达rht...     

L-苏氨酸产生菌的原生质体融合育种研究

采用原生质体融合等技术,以谷氨酸棒杆菌GY360 (Mer+ AECr+ AHVr)为亲株(A)与乳糖发酵短杆菌HS58 (Ala-+ AHVr )为亲株(B)进行原生质体融合,选育出一株产L-苏氨酸菌NRH66,该菌株遗传标记为Met-+ Ala-+ AEC+ AHVr,在摇瓶上发酵可产L-苏氨酸46.2g/L,比亲株A产酸提高了17.7%,比亲株B产酸提高64%.     

常温常压等离子体诱变选育高产L-异亮氨酸谷氨酸棒杆菌

以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）23798为原始菌株,对其进行常温常压等离子体（ARTP）诱变,以磺胺胍抗性和氨基酸与茚三酮特异显色为筛选标记,以期得到高产L-异亮氨酸的诱变谷氨酸棒杆菌,并对其遗传稳定性进行研究。结果表明,原始菌株23798经过ARTP诱变处理180 s后,经0.4 mg/mL磺胺胍抗性筛选、多孔板高通量筛选、发酵培养复筛,选育出一株高产L-异亮氨酸诱变谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）B1。该菌株在摇瓶中发酵培养48 h,L-异亮氨酸产量达18.5 g/L,比原始菌株提高62.03%,且遗传性状稳定。     

基于低拷贝质粒的高产紫色杆菌素谷氨酸棒杆菌的构建和发酵

该研究以公认安全(Generally Recognized as Safe,GRAS)的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为宿主,构建高产紫色杆菌素的重组菌株。利用谷氨酸棒杆菌天然大质粒pTET3的复制与分配元件,构建了低拷贝质粒pOK12CG1,该质粒在谷氨酸棒杆菌中的拷贝数约为6拷贝/基因组,且与谷氨酸棒杆菌常用质粒pEC-XK99E和pXMJ19兼容。以低拷贝质粒pOK12CG1为骨架构建了携带紫色杆菌素合成操纵子(vioABCDE)的质粒pCGvio,并分别以谷氨酸棒杆菌标准株ATCC 13032和插入序列(Insertion Sequence,IS)元件删除株为宿主,构建了7株合成紫色杆菌素的重组菌株。通过初步筛选,发现基于低拷贝质粒的重组菌株ATCC13032/p CGvio,其紫色杆菌素产量(508.24 mg/L)高于基于中高拷贝质粒的重组菌株ATCC 13032/pECvio(376.16 mg/L),而基于低拷贝质粒的IS元件删除重组菌株ISDM023/pCGvio紫色杆菌素产量达到了610.13mg/L。进一步采用正交实验设计对重...     

基于响应面法优化谷氨酸棒杆菌发酵条件

该研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）P169为研究对象,以谷氨酸产量为主要评价指标,采用单因素试验和响应面法对其发酵条件进行优化,并进行摇瓶和20 L罐分批补料发酵验证。结果表明,谷氨酸棒杆菌P169产谷氨酸的最佳发酵条件为酵母粉41.0 g/L、葡萄糖27.0 g/L、尿素12.0 g/L和pH 7.0。在此优化条件下,谷氨酸产量达25.1 g/L,比优化前（16.5 g/L）提高了52.1%。以此为基料进行20 L罐分批补料发酵,谷氨酸产量达155 g/L,比优化前（142 g/L）提高了9.2%。该研究为提高谷氨酸棒杆菌谷氨酸产量提供了一种技术解决方案。     

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶

为了获得四氢嘧啶生产菌株并利用此菌株提高四氢嘧啶产量,以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）野生菌株ATCC13032为研究对象,以赖氨酸积累量为评价指标,强化了天冬氨酸-β-半醛合成代谢流;通过阻断赖氨酸输出通道LysE,表达不同来源的四氢嘧啶操纵子ectABC,获得了四氢嘧啶生产菌株;通过强化天冬氨酸转氨酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生途径,进一步提高四氢嘧啶产量。结果表明,构建了一株高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株LYS-3,赖氨酸积累量为28.48 g/L;表达操纵子HEectABC的谷氨酸棒杆菌ECT-3四氢嘧啶产量达到17.21 g/L;过表达基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒杆菌ECT-6,摇瓶发酵四氢嘧啶产量达到21.85 g/L。研究结果可为天冬氨酸-β-半醛衍生物的生物合成提供参考。     

产谷胱甘肽重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究

考察了培养基组成及培养条件对重组巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)x-33(pGAPZA-gsh 1)合成谷胱甘肽(GSH)的影响。优化后的培养基组成为:甘油30g/L、蛋白胨40g/L、酵母膏9g/L、半胱氨酸0.36 g/L、KH_2PO_4 3g/L;培养条件为:自然pH、摇床转速200r/min、装液量为30mL/250mL、接种量为10%。在此优化条件下重组酵母的GSH产量是98.5mg/L,为优化前的2.33倍,生物量最大值达到19.6g/L。在5L发酵罐上进行放大实验,发酵结束后GSH产量、重组菌的生物量分别为97.9mg/L,18.7g/L与摇瓶发酵结果基本吻合。     

豆豉溶栓酶液态发酵工艺研究

对豆豉中筛选到的1株溶栓酶产生菌-枯草芽孢杆菌HGD107,进行摇瓶和15L发酵罐液态发酵工艺研究。在最适发酵条件下,摇瓶发酵产豆豉溶栓酶酶活达到3643U/mL发酵液(尿激酶单位),15L发酵罐发酵产豆豉溶栓酶酶活达到2050U/mL发酵液(尿激酶单位)。     

二十碳五烯酸高产菌株的诱变选育及柠檬酸对其油脂合成的影响

利用UV-LiCl复合诱变腐霉出发菌株,通过低温培养和苏丹Ⅱ染色镜检初筛、摇瓶发酵复筛,获得1株二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid,EPA)高产菌株腐霉H6,经20℃-15℃二阶段培养168 h,所得生物量、油脂含量和EPA含量分别为23.50 g/L、17.54%和15.36%,EPA产量为633.17 mg/L,较出发菌株(263.80 mg/L)提高了140.02%,且产量、性状稳定。添加不同浓度柠檬酸对腐霉H6油脂合成调控的研究表明,发酵中期添加1.5 g/L柠檬酸可显著增加葡萄糖的利用率,提高油脂含量和EPA含量,EPA产量达890.49 mg/L,与对照相比提高40.64%。发酵实验表明腐霉H6极有潜力开发成为工业化生产菌种。     

非诱导型基因重组工程菌发酵产人血清白蛋白各种参数的变化规律

以无甲醇诱导型基因重组人血清白蛋白的毕赤氏酵母(Pichia pastoris) NCY-1为实验菌株,在10 L机械搅拌通风发酵罐水平和3 L摇瓶水平的基础上研究了该菌株发酵过程中参数的变化规律及铵根离子（NH4+）对发酵液中重组人血清白蛋白（rHSA）的影响。研究结果表明：发酵液中的rHSA的含量随菌体浓度的增加而增加;30 h后菌体进入稳定期,此时流加10 g/L的葡糖糖有利于发酵液中rHSA的表达,流加后发酵液中的rHSA最高产量可达到185 mg/L;发酵液中存在活性较高的蛋白酶,在发酵后期分解rHSA,但发酵液中铵离子（NH4+）质量浓度为3.0 g/L时能较好的抑制rHSA的分解。