米根霉原生质体电融合条件研究

以米根霉突变株mut-A、mut-B为亲本,采用双亲灭活标记筛选融合子,对亲本灭活条件、原生质体电融合条件进行了研究。实验结果表明,0.6mol/L山梨醇溶液为最适的渗透压缓冲液,mut-A、mut-B的灭活条件分别为50℃加热6min及紫外照射180s。原生质体在电场中排队所需的细胞浓度为1×107/mL,交变电场电压为8V;最佳的电融合参数为直流脉冲电压260V,脉冲持续时间40μs,脉冲次数2次;最高融合率可达7.29±0.71%。     

原生质体融合法构建增香型苹果酒酿造酵母的研究

以具有强发酵能力的酿酒酵母1605和产香能力好的苹果酒酵母E2为亲本,通过对原生质体融合条件的研究,得出以下结论:根据两亲本的生长曲线图确定两亲本在制备原生质体时的前培养时间为4h;在酶解温度35℃、蜗牛酶终质量分数为1%的条件下,最佳酶解时间为80min,此时,亲本菌株1605的原生质体形成率和再生率分别为92.4%和29.5%,亲本菌株E2的原生质体形成率和再生率分别为93.5%和30.7%;在60℃时,对亲本菌株1605的原生质体水浴灭活15min,即可完全抑制或钝化其原生质体活性。通过对融合子酿造苹果酒的感官和主要香气成分的分析,利用模糊综合评判法优选出8#菌株,该菌株具有产香能力好、发酵能力强的双亲优点,为优良的增香型苹果酒酵母菌株。     

原生质体电融合选育米曲霉新菌株的研究

本实验对米曲霉AS3．951和CICC2339的原生质体进行紫外灭活,然后对灭活双亲用CRY-3型细胞电融合仪进行原生质体电融合。通过筛选得到EF113和EF222两株融合株,其酶活力分别达到了7680U/g和7200U/g,远高于酶活低的亲本菌株AS3．951。     

原生质体电融合法构建葡萄酒降酸酵母的研究

以发酵性能优良的葡萄酒酵母F83和具有降解苹果酸能力的酒类酒球菌作为亲本菌株,进行电融合,构建发酵性能良好且具有降解苹果酸能力的葡萄酒酵母菌株.结果表明,两亲本菌株原生质体电融合的最佳条件为:交变电压55 V,交变电场频率1000 kHz,脉冲宽度30μs,脉冲个数5个.共获得13株融合株,其中10号融合子发酵、降酸性能较佳.     

电融合原生质体构建麦角甾醇酵母菌株的研究

实验采用细胞电融合技术进行麦角甾醇酵母菌株构建研究,在不同种属的酵母菌种进行筛选研究,确定麦角甾醇含量较高酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和细胞生物量较高产朊假丝酵母(Candi-dautilis)为亲本菌株,进行原生质体制备、原生质体再生、原生质体灭活和原生质体融合研究,确定电融合过程中电压、脉冲强度、脉冲间隙及脉冲次数等技术参数,并筛选出融合子PF-4。经发酵性能实验表明,PF-4的细胞生物量为33.17g/L,麦角甾醇含量为2.01%,均高于亲本菌株,为玉米发酵法制备麦角甾醇酵母提供生产菌株。     

双亲灭活电融合技术选育酱油生产菌株

选择互补且各具优势的2株米曲霉A98和A33为出发菌株,研究了其原生质体制备和电融合条件.接种YPD液体培养基,30℃摇瓶培养11h获得菌丝.以0.6mol/L甘露醇为渗透压稳定剂,最佳破壁酶液为溶壁酶∶蜗牛酶∶纤维素酶=1∶1∶1,浓度为10mg/mL,28℃酶解2.5h时原生质体浓度达到108个/mL,再生率≥20％;最佳电融合条件为1MHz交流频率,交流场强300V/cm,直流场强6kV/cm,脉冲间隔60μs,脉冲个数3;在此条件下,电融合率达到10-5.对获得的融合子进行酱油发酵筛选,以原料收得率为关键考察指标,筛选获得了1株融合子F01-008,其原料收得率较亲本较高者提高了5.61％.     

原生质体电融合选育维生素K2高产菌株

试验采用双亲灭活原生质体电融合选育维生素K2高产菌株,探究了灭活和电融合条件。结果表明:经热灭活和紫外灭活后,在成串脉冲频率2 MHz,成串电压32 V,脉冲融合电压500 V,脉冲宽度40μs,脉冲个数6个的条件下进行电融合,筛选得到一株优良菌株BKU-6,其维生素K2的产量达到39.6 mg/L,远高于产量低的亲本菌株CICC10262。     

利用原生质体融合技术构建梨酒酵母工程菌

以菌株酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae YDJ05及产香酵母Issatchenkia orientalis YS03为融合亲本X和Y,通过原生质体融合技术构建适合梨酒酿造的酵母工程菌,研究结果表明:利用EMS诱变亲本菌株Y,得到了一株精氨酸营养缺陷型菌株,亲本菌株X和Y采用蜗牛酶液在35℃下处理100min,得到菌株X、Y的原生质体融合率分别为93.6％、94.2％,再生率分别为27.8％、31.6％.以加热的方式灭活亲本菌株X,灭活时间为14min.在以PEG为促融剂的条件下对两株菌进行原生质体融合,经过优选得到融合子D J02,其产酒精率、产香率等指标最优,分别达到了9.87％、0.37g/L.     

产番茄红素红酵母基因组重排实验条件的优化

目的:探索基因组重排技术应用于产番茄红素红酵母育种中关键步骤的最优条件.方法:本实验以3株产生番茄红素的红酵母ep-2-11、cp-2-6、cp-28为实验菌株,研究菌体培养时间、酶解浓度、酶解时间、灭活条件以及融合时间对基因组重排的影响.结果:当菌体培养12h,酶解浓度为2％,酶解70min时,原生质体制备与再生率最佳;15w紫外灯,照射距离为35cm,磁力搅拌50r/min的条件下照射18min,60℃下灭活35min作为双亲灭活条件;35％聚乙二醇4000(PEG-4000)作为融合剂,处理23min为最佳融合时间.结论:通过基因组重排最佳条件的确定,后续重排实验的效率得到很大的提升,最终筛选出了高产的目的菌株,产量较融合亲本提高了122％.     

原生质体融合法构建γ-癸内酯高产菌株

该文确定了亲本原生质体制备的最佳条件为:采用0.3%β-巯基乙醇和0.1mol/L EDTA-Na2的复合预处理剂于28℃预处理10min,高渗稳定剂为1 mol/L pH 6.0的山梨醇,蜗牛酶浓度为2%、酶解温度为35℃、时间为2h.经过原生质体融合实验,成功获得了多株高产菌株,其中以QY30 γ-癸内酯产量最高为1.4852g/L,比亲本Y1-2提高了2 82倍.该菌株遗传性状基本稳定.