粗糙脉孢菌突变菌株合成漆酶的发酵条件研究

研究了影响粗糙脉孢菌突变菌株合成漆酶的一些摇瓶发酵条件，包括通气量、培养温度、甲醇浓度、Cu2＋浓度等。结果表明，在500mL三角瓶中装入含150μmol／L Cu^2＋浓度的发酵培养基BMMY 50mL，接种后于30℃，200r／min培养7d，用0．5％甲醇诱导，在第5天时漆酶酶活最高可达3．88u／mL。     

漆酶基因的克隆及在甲醇毕赤酵母中的表达

以白腐菌杂色云芝RNA为模板,通过RT—PCR获得不带自身信号肽漆酶Lccl基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pMETαA—Lccl,并将其线性化后用电穿孔法导入Pichia methabolica PMAD16,PCR结果表明Lccl基因已经整合到甲醇毕赤酵母染色体上。经摇瓶培养筛选出表达水平较高的酵母菌株,漆酶酶活力达78U／L。     

金属铜、锰离子对粗糙脉孢菌漆酶合成的影响

研究了金属离子铜、锰对粗糙脉孢菌合成漆酶的影响。结果表明：10μmol／L的铜离子产生的漆酶活力最高(4.01 U／ml)，是不加铜离子的2．62倍：150μmol／L的锰离子产生的漆酶活力最高(5．05 U／ml)，是不加锰离子的4．1倍．说明适量的金属离子铜、锰对粗糙脉孢菌合成漆酶是有利的，但是这一合成调控的机制有待进一步深入研究。     

诱导条件下营养因子对粗糙脉孢菌合成漆酶的影响

研究了粗糙脉孢菌合成漆酶的一些重要影响因素，包括诱导剂种类、碳源、氮源。获得了粗糙脉孢菌合成漆酶的较适宜每件：以20g／L葡萄糖为碳源，2g／L硝酸铵为氮源，粗糙脉孢菌静止培养2-3d后，再加入放线菌酮（终浓度2．8μmol／L）诱导培养6—7d后产生的漆酶的最高酶活可达4-5u／mL。     

Coprinopsis cinerea 漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

本文通过RT-PCR从Coprinopsis cinerea okayama7#130中克隆得到laccase1,应用SignalP3.0Server软件分析其氨基酸序列后设计不含信号肽序列的新引物扩增得到不含信号肽的漆酶基因1（lac1）,并构建重组酵母表达载体pPIC9K-lac1,电击转化毕赤酵母GS1115并用甲醇诱导表达,之后研究重组酶的酶学性质。克隆得到的laccase1全长为1593bp,编码530个氨基酸,其中信号肽包含18个氨基酸。SDS-PAGE显示重组蛋白大小约为65KDa。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为45℃,最适pH为4.3。重组漆酶在45℃保存3h后活性基本保持不变,在pH4.0～10.0的范围内稳定性较好。成功分泌表达的漆酶活力达到1.108U/mL。     

粗糙脉孢菌木聚糖酶酶学性质的研究

对粗糙脉孢菌木聚糖酶粗酶的酶学性质进行了研究,结果表明:该木聚糖酶的最适反应温度50℃、pH值为5.8,温度低于50%、pH 4.6～7.4时该酶稳定性较好;金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+对该酶的活性有促进作用,K+、Na+、Pb2+、Cu2+、Fe3+、Al3+对酶的活性有抑制作用;EDTA、SDS、DMSO对该酶活性的抑制作用较小;以木聚糖为底物的酶动力学常数Km和Vmax值分别为1.30g/L和1.35μmol/(min·mL).     

杂色云芝漆酶基因在甲醇毕赤酵母中表达条件研究

重组甲醇毕赤酵母（Pichia methanolica）工程菌PMADl6／pMETA-Lccl能分泌表达杂色云芝重组漆酶。本文通过对其发酵条件的研究，找出摇瓶发酵表达漆酶的最适培养条件：在BMMY培养基中添加0．2mmol／L的Cu^2＋．装液量为25mL／250mL三角瓶，接种量体积之比为45：25，0．5％甲醇诱导，20℃条件下摇瓶培养5d，漆酶最高酶活力达1192U／L。     

克氏担孢酵母脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

以克氏担孢酵母V3脂肪酶基因为研究对象,构建毕赤酵母稳定的高效表达系统。采用同源克隆法从克氏担孢酵母V3中获得一个脂肪酶基因,并将其构建到表达载体pPICZαA,转入毕赤酵母X33中,成功实现了克氏担孢酵母V3脂肪酶基因在毕赤酵母X33中的表达。重组工程菌摇瓶培养120 h后,酶活力可达18 U/mL。重组酶的最适反应温度为60 ℃,最适pH值为5.0。1 mmol/L的Mg2+、K+和Na+以及质量浓度为1 g/100 mL的曲通-100、吐温-80、吐温-20对重组KLIP具有激活作用。重组酶的最适底物为三硬脂酸甘油酯（C18）。     

海藻糖合酶基因在毕赤酵母中的表达

首次构建来源于恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因（AE015451.1）的真核表达载体,探索在毕赤酵母中的表达。PCR扩增目的基因,经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切后连接至同样双酶切的pPICZaA中,经PCR检测和序列测定准确后,通过电击法将重组质粒转入毕赤酵母GS115中,利用含Zeocin的YPD平板筛选到阳性转化子,提取阳性转化子基因组并利用特异性引物PCR得到一条与目的基因大小相同的条带,说明目的基因转入成功,诱导重组蛋白表达并用SDS-PAGE检测可见一条约76 ku与目的蛋白大小预测相符合的蛋白条带,最后HPLC检测重组蛋白可将麦芽糖特异转化为海藻糖,说明外源表达的海藻糖合酶具有一定酶活。通过PCR、SDS-PAGE和HPLC结果说明成功构建重组pPICZaA-TreS质粒并整合到巴斯德毕赤酵母的基因组上,且海藻糖合酶基因得到预期的表达并具有活性,为下一步研究奠定基础。     

重组毕赤酵母产植酸酶的性质初步研究

对基因工程重组酵母的植酸酶进行分离和纯化,并考察纯化酶的酶学性质。结果表明,该植酸酶酶蛋白分子量为60ku;有2个pH值活力峰:pH值为3.5和pH值为5.5;最适反应温度为60℃;在37℃下以植酸钠为底物的反应初速度为128μmol/(L·min),米氏常数为228μmol/L;Cu2+对此酶有较强的抑制作用;Mg2+,Ca2+,Al3+,Fe2+,Co2+,Zn2+和EDTA等对酶活性影响不大。     

蛹虫草中谷氨酰胺转氨酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

谷氨酰胺转氨酶(TGase或TG)是一种可催化蛋白质间形成异肽键,使蛋白质改性的天然酶制剂。本文以蛹虫草基因组为模板,通过PCR扩增得到TGase相似蛋白的基因片段tgM,将其与大肠杆菌-毕赤酵母穿梭表达载体pPIC9K连接,构建重组表达载体pPIC9K-TG,在毕赤酵母中进行表达,实现目的蛋白的胞外分泌表达,结果发酵液中重组TGase的酶活力为100 U/L。本研究为TGase的异源表达及潜在的工业应用提供参考。     

棘孢青霉右旋糖酐酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达

以右旋糖酐酶产生菌棘孢青霉F1001基因组为模板反转录合成右旋糖酐酶的cDNA（dex）,基因全长1 866 bp,根据毕赤酵母密码子偏好性优化dex序列获得优化右旋糖酐酶基因（opt-dex）,分别构建dex-pPICZαA和opt-dex-pPICZαA重组质粒,电击转入毕赤酵母X33中构建重组子。通过蓝色右旋糖酐T-2000平板以及摇瓶发酵筛选获得产右旋糖酐酶的重组酵母菌株。重组酶的酶学性质分析显示,重组酶分子质量65?kDa、最适pH?5.0、最适温度35?℃,专一作用于α-1,6糖苷键。在摇瓶水平上对重组毕赤酵母表达条件进行优化,优化培养条件为培养温度25?℃、初始pH?5.0、每24?h甲醇添加量1%（体积分数）、每24?h山梨醇添加量5?g/L、吐温-80添加量4?g/L、摇瓶装液量50?mL/500?mL锥形瓶,优化后的重组右旋糖酐酶分泌表达酶活力提高到240.74?U/mL。重组酵母X33是一株适合外源表达棘孢青霉右旋糖酐酶基因的工程菌,该重组酶可替代棘孢青霉右旋糖酐酶直接应用于工业生产催化制备右旋糖酐。     

米黑根毛霉脂肪酶基因在毕赤酵母中的高效表达

脂肪酶是主要工业用酶制剂之一,在食品、洗涤剂和制药等领域广泛应用。将编码米黑根毛霉(Rhizo-mucor miehei)脂肪酶RML的基因克隆到pPIC9K载体中,构建了分泌型表达载体pPIC9K-RML,载体经线性化后转化Pichia pastorisGS115,G418梯度筛选获得了分泌表达RML的重组毕赤酵母工程菌,SDS-PAGE分析显示表达的脂肪酶分子量大小与预期一致。初步研究表明,重组脂肪酶最适温度为40℃,最适pH值为8.0,以橄榄油为底物时,发酵上清液酶活最大可达102 U/mL,表明构建的重组毕赤酵母工程菌具有较好的工业化生产潜力。     

重组牙鲆生长激素基因片断在毕赤酵母中的表达

为了开发一种有效的重组牙鲆生长激素(r-fGH)的方法,利用PCR的方法从牙鲆eDNA文库中克隆得到了牙鲆生长激素(fgh)的cDNA片断.接着将这个fgh片断克隆到整合型质粒pAO815,它可以在甲醇诱导启动子的调控下表达外源蛋白.利用这种包含一个fgh插入片段的克隆来构建含有2个和3个头尾顺序排列的fgh表达框的表达质粒.利用氯化锂转化的方法将所构建的质粒转化到毕赤酵母GS115,然后进行筛选、培养和0.5%甲醇诱导表达,最后得到重组表达的牙鲆生长激素.     

粗壮脉纹胞菌发酵产类胡萝卜素的研究进展

在归纳整理现有的关于粗壮脉纹胞菌产类胡萝卜素的文献的基础上,论述了粗壮脉纹胞菌产类胡萝卜素的生成途径、途径中涉及到的酶以及相关的基因,同时探讨了国内外已发现的影响粗壮脉纹胞菌产类胡萝卜素的影响因素,最后分析了当前研究中存在的问题,指出了进一步研究的方向。