盐酸羟胺和紫外线复合诱变选育纳豆激酶高产菌株

以从日本纳豆中分离出的1株枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtlis natto,简称纳豆菌)NT-6为出发菌株,通过盐酸羟胺和紫外线复合诱变处理,采用利福平抗性平板筛选和发酵筛选相结合的方法,获得了1株突变株NT207,其产酶能力比诱变前提高了68%,在未经优化的液态发酵条件下,纳豆激酶的酶活力达到了648.72IU/mL。     

纳豆菌B-12产纳豆激酶条件及酶学性质研究

以纳豆菌B-12为出发菌株,对其液体发酵产纳豆激酶的条件及纳豆激酶部分酶学性质进行了研究。实验研究了碳源、氮源、接种量、发酵时间、发酵温度和培养基初始pH值对纳豆菌B-12产酶的影响,在优化发酵条件下,纳豆菌B-12产酶量相当于尿激酶903IU/mL。纳豆激酶在50℃,热稳定性较好,保温100min残余酶活力保持80%左右;在pH6.0-9.0较稳定,残余酶活力保持在近80%左右;金属离子Fe3＋、Al3＋对纳豆激酶有明显的抑制作用,Zn2＋有微弱的促进作用。     

双菌混合发酵纳豆工艺优化

利用水解圈菌落直径比值(C/H)、菌株生长曲线、发酵纳豆激酶酶活和挥发性盐基氮含量,筛选出两株较优纳豆菌;再以纳豆激酶酶活和挥发性盐基氮含量为指标,对双菌株发酵纳豆工艺条件进行优化。结果表明,双菌株发酵制备纳豆最优工艺条件为菌种比例(m_N5∶m_N3)4∶1,接种量9%,发酵时间25 h,发酵温度35 ℃。此条件下制备的纳豆激酶酶活可达481.84 U/g,与单菌发酵相比提高了36.8%,挥发性盐基氮含量为205.21 mg/100 g,与单菌发酵最高值相比降低了42.3%。     

中式纳豆制备技术的研究

为探索出符合中国人口味且纳豆激酶酶活力高的中式纳豆加工技术,该研究从市售的4种纳豆中分离出4株纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）,并筛选出一株产纳豆激酶能力最强的菌株NK3。以牛奶培养基替代传统的种子液培养基培养纳豆菌种,通过单因素试验考察发酵温度、时间、接种量、加水量对纳豆激酶酶活力的影响,采用正交试验优化纳豆发酵条件。结果表明,以牛奶为培养基培养的纳豆菌生长良好,在发酵温度27 ℃、发酵时间1.5 d、接种量5%、加水量6%条件下,菌株NK3发酵制备出的纳豆无氨臭味,有淡淡的奶香味,且纳豆激酶酶活力高达668.5 U/g。     

纳豆激酶制剂的研究

以选取的纳豆菌-9号为出发菌株，在最佳摇瓶培养条件基础上通过5L发酵罐扩大培养，确定最优发酵培养条件，纳豆激酶活力较摇瓶培养提高2．05倍；发酵液经真空冷冻干燥得到纤溶活性较高的纳豆激酶干粉，并对纳豆激酶干粉的部分酶学性质进行了研究。     

纳豆菌分离、鉴定及纳豆激酶高产菌株的正向选育

从日本纳豆食品中分离到1株枯草芽孢杆菌纳豆亚种(Bacillus subtilis natto)Bs01-1菌株,根据纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶与蛋白酶活性的正相关关系,采用紫外线直接照射涂菌蛋白平板进行诱变育种的,成功地筛选到2株突变株MBS04-6和MBS04-9,其溶纤活性分别比出发菌株提高了87%和69%,达到4 179 IU/mL和3788 IU/mL。该法筛选菌株的正向突变率达到10%。     

直投式纳豆发酵剂生产菌株的定向筛选

为了制备直投式纳豆菌发酵剂,采用稀释平板分离法,从日本纳豆中筛选出4株纳豆芽孢杆菌优势菌株。通过比较这4个分离菌株与实验室保存的纳豆芽孢杆菌菌株的耐受性和产酶能力,优选出一株作为制备直投式纳豆发酵剂的菌种。     

一株高产纳豆激酶菌株的筛选及其发酵条件的优化

通过紫外诱变、纤维蛋白原平板初筛、复筛得到了一株高产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌菌株。研究液体发酵产纳豆激酶的最佳条件,结果表明最佳培养基为营养肉汤,最佳培养时间为24h,最佳培养温度30℃。在优化条件下,发酵液酶活达640U/ml。该菌株的酶活比原始菌株酶活提高了258%。     

原生质体紫外诱变选育纳豆激酶高产菌株

以纳豆菌B．N．K为出发菌株，在适宜条件下制备和再生原生质体，并结合紫外线诱变筛选纳豆激酶高产菌株。经过原生质体紫外诱变的重复处理、摇瓶复筛和遗传稳定性试验，最终得出5株高产菌株即DU104、DU115、DU120、DU212、DU223，酶活分别为383．65、400．74、327．15、347．16、378．98IU／ml，比出发菌株B．N．K分别提高了67．1％、74．5％、42．5％、51．2％和65．0％。     

纳豆激酶高产菌株的选育及固态发酵技术

以枯草芽孢杆菌为出发菌株,选用超声波和紫外线进行诱变处理,根据致死率、突变率与诱变剂量的关系选择合适的诱变剂量,以筛选高产纳豆激酶的优势菌株。实验表明：最佳诱变条件为：超声波45 kHz、280 W,时间60 min,紫外线照射距离30 cm,时间120 s。经多次初筛、复筛,选育出一株命名为BSCZ-4的优势菌株,其纳豆激酶酶活力为原始菌株的1.96 倍。对该菌种进行连续20 代培养,测得其溶解圈直径稳定在18～19 mm之间,表明该突变株遗传特性稳定。并采用Box-Behnken响应曲面法优化其固态发酵工艺条件,结果为：魔芋精粉添加量5%、接种量8%,34 ℃发酵24 h,纳豆激酶活力可达（4 087.83±93.75） U/g。     

枯草芽孢杆菌筛选及其产纳豆激酶的液态发酵条件优化

为了提高现有纳豆激酶产量,促进其工业化生产与应用,本文从不同产地的鲜纳豆中分离出枯草芽孢杆菌,先后通过菌落形态初筛与酪蛋白平板复筛,选出水解圈与菌落比值较大的菌株,测定其发酵液中纳豆激酶酶活,选定一株酶活相对较高的菌株X3.通过系统16S rDNA测序鉴定和系统发育树对比,确定X3菌株为枯草芽孢杆菌.在单因素试验的基础...     

一株产纳豆激酶菌株的分离筛选及鉴定

对能产生纳豆激酶的菌群进行了筛选,分离得到了1株具有较高纤溶活性的菌株N391,其纳豆激酶相当于1722.4U/mL尿激酶的酶活。利用细菌16S rDNA通用引物对其16S rRNA进行PCR扩增,得到1511bp的片段,该PCR产物序列通过Blast软件在NCBI网站中进行同源性比较,通过DNA MAN和MAGE3.1软件绘制系统发育树,结果表明,菌株N391的16S rRNA序列(DQ906100)与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)的16S rRNA序列的同源性在99%以上,在系统发育树中,菌株N391与Bacillus subtilis在同一分支,且遗传距离最短。结合常规的形态、生理生化鉴定,N391的形态及大部分生理生化特征与Bacillus subtilis极为相似,表明菌株N391属于Bacillus subtilis的1个菌株,由此初步确定该菌在微生物系统发育学上的地位。     

纳豆激酶高产菌的快速筛选及其发酵纳豆特性

通过纤溶活性筛选法和纳豆激酶基因筛选法,快速、准确筛选到一株纳豆激酶高产菌株MJ-1,经16S rRNA基因序列分析,该菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌。以黄豆为原料进行固体发酵制备纳豆食品,考察了纳豆食品的纳豆激酶活力、抗凝活性和抗氧化活性。在初始含水量60%、发酵温度37 ℃的条件下,纳豆激酶发酵活力在20 h达到最大值（90.18 FU/g,以干质量计）,达到了商业化纳豆的酶活力水平。抗凝活性分析显示该菌株可合成抗凝成分,赋予纳豆食品抗凝活性,在提取物质量浓度为3 mg/mL时,抗凝效率达91%。同时,与未发酵黄豆相比,发酵过程显著提高了其抗氧化活性。     

高产纳豆激酶地衣芽孢杆菌工程菌全合成培养基优化

以产纳豆激酶的地衣芽孢杆菌基因工程菌BL10（pP43SNT-SsacC）为出发菌株,开展其全合成培养基的发酵优化研究。通过单因素试验和正交试验优化了全合成培养基成分,获得了最优的培养基组成（g/L）：葡萄糖30、NaNO3 30、谷氨酸钠20、柠檬酸钠15、MgSO4·7H2O 0.5、K2HPO4·3H2O 1.5、CaCl2 0.5,pH 7.2。在优化的全合成培养基中,纳豆激酶最高酶活力达到25.59 FU/mL,相比于初始培养基发酵活性（4.27 FU/mL）,提高了5 倍。对比分析了全合成培养基和半合成培养基的发酵产物,结果表明,全合成培养基可显著提高纳豆激酶的纯度,与半合成培养基相比,纳豆激酶比活力提高了2 倍。本研究获得了纳豆激酶的全合成培养基成分,显著提高了纳豆激酶发酵活性,并进一步提高了纳豆激酶发酵纯度。     

抗呋喃唑酮单克隆抗体的制备及其应用

为实现呋喃唑酮（furazolidone,FZD）的快速定量检测,本研究制备了抗FZD全抗原的单克隆抗体,建立了抗FZD的单克隆抗体酶联免疫检测方法。结果表明,FZD单克隆抗体在质量浓度为10～500 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为0.06 μg/mL,最低检测限为6.92 ng/mL,对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢物均不存在交叉反应。该方法重现性较好,平均误差为6.54%,回收率为76.84%～88.31%。     

嗜热链球菌发酵改良纳豆工艺优化

采用嗜热链球菌为改良菌种,通过二次发酵改良纳豆。熟制灭菌后的大豆在纳豆菌接种量2%、发酵温度37℃、发酵时间24 h条件下进行一次发酵。以嗜热链球菌的发酵温度、发酵时间、接种量为因素,以感官评分、纳豆激酶酶活为指标,通过单因素和响应面实验,研究嗜热链球菌二次发酵改良纳豆的最佳工艺条件。结果表明:在发酵温度42℃、发酵时间18.6 h、接种量1.5%时改良效果最佳,得到的感官评分为8.0分,纳豆激酶酶活为1964 U/g。改良效果较好,纳豆臭味下降,纳豆激酶酶活提高。