中温α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其发酵条件优化

以枯草芽孢杆菌为表达系统,以中温α-淀粉酶为目标蛋白,研究了启动子和信号肽对外源蛋白表达分泌的影响。分别选取了4种启动子以及8种信号肽来进行筛选,结果表明,启动子PApr E的强度最高,信号肽SPnpr E的分泌效率最好。针对重组菌株1A751Q31进行系统的发酵优化,在72 h发酵液中α-淀粉酶酶活达到380U/m L。在7.5 L发酵罐中进行放大实验,发酵液中α-淀粉酶酶活最高达到853 U/m L。以上研究表明,α-淀粉酶适合在枯草芽孢杆菌中进行表达,同时表明枯草芽孢杆菌是良好的异源蛋白表达系统。     

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9?种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽YfkN的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽YfkN的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715?U/mL。重组α-淀粉酶PFA的最适反应pH值为5.0,最适反应温度为100?℃,于100?℃的半衰期长达13?h,并且不依赖于Ca2＋。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。     

甜蛋白monellin基因在酿酒酵母中的分泌表达

人工合成的单链甜蛋白monellin基因与经改造后的基因分别克隆到带有酵母半乳糖可诱导启动子GAL1的穿梭表达质粒pYES2.0中,得到表达载体pYESM及pYESMT。在表达载体pYESMT中,monellin基因的上游连接酿酒酵母的α-信号肽序列,得到分泌表达载体pYESMTA。分别将3个重组质粒转化酿酒酵母菌株INVsc1中进行表达。具有突变monellin基因的菌株INVMT/pYESMT的monellin蛋白表达量明显高于含monellin基因的菌株。而含有pYESMTA的菌株可将monellin基因分泌到胞外,表明α-信号肽序列能很好地将酿酒酵母中的重组monellin蛋白引导到胞外,完成分泌表达,且表达产物具有生物活性。     

土壤宏基因组中芽孢杆菌信号肽的克隆及分析

从土壤宏基因组中筛选获得在芽孢杆菌中高效分泌重组蛋白的信号肽。通过数据分析,将预测到的信号肽DNA片段与蛋白酶基因融合,在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB800和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DL6中表达,进行胞外蛋白酶酶活测定。筛选得到25个可能来源于G+菌的信号肽序列,胞外蛋白酶活性分析的结果显示,有14个信号肽具有较好的分泌蛋白酶的能力,其中引导效果最好的信号肽（sig20）是蛋白酶自身信号肽的1.64倍。将高分泌信号肽转化到地衣芽孢杆菌中,证实其在地衣芽孢杆菌同样具有较好的引导效果。应用生物信息学与宏基因组学相结合的方法,可有效获得高效的芽孢杆菌信号肽序列,为蛋白质高效分泌表达系统的构建提供丰富的表达元件。     

酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的高效表达

酸性α-淀粉酶是发酵行业用量最大的酶类,为了实现酸性α-淀粉酶基因的高效表达,将本实验室已经克隆得到的去信号肽的酸性α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌WB600宿主中进行表达,成功的构建了表达菌株pHT43-amy/WB600。在初始菌浓度OD600为0.8时加入终浓度为0.9 mmol/L的IPTG,诱导6 h的条件下测得酶活力为1 230 U/mL,又由于宿主菌WB600外分泌蛋白较少,因此具有明显的生产优势。     

重组β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达及其在糖化反应中的应用

β-淀粉酶(β-amylase,Amy M)是一种重要的工业用酶,广泛应用在啤酒酿造、制糖等行业中。本研究利用Bacillus megatherium DSM 319来源的β-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6051?10)中分泌表达。首先,构建不同单启动子和双启动子介导β-淀粉酶表达的重组菌株,在摇瓶培养条件下,由P43-P43介导的双启动子重组菌株在发酵培养27 h时,分泌β-淀粉酶酶活力最高达2950.76 U/m L;随后研究碳代谢阻遏效应(Carbon Catabolite Repression,CCR)对重组β-淀粉酶表达的影响,发现对分解代谢控制蛋白(Catabolite control protein A,Ccp A)在DNA上顺式调控元件的碱基位点进行定点突变,可以有效缓解碳阻遏效应,β-淀粉酶酶活提高到4663.03 U/mL;最后,将重组β-淀粉酶应用在糖化反应过程中,结果表明麦芽糖转化率可以达到57.62%。综上,本研究成功构建出β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达体系,为工业化生产β-淀粉酶提供了理论数据支撑。     

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外.重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积...     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。     

芽胞杆菌XM-1酸性α-淀粉酶基因的克隆及原核表达

为使枯草芽胞杆菌XM-1菌株酸性α-淀粉酶基因高通量表达,提高酶产量,利用PCR方法从基因组DNA中扩增出该酶基因As-Amy,并构建pET30a(+)/As-Amy原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功表达。测序结果表明As-Amy基因编码框全长为1434bp(Genbank登录号GQ153530),编码477个氨基酸,预测蛋白质分子质量为61ku。序列比对分析表明,As-Amy与多个枯草芽胞杆菌α-淀粉酶基因相似性在98%以上,所编码氨基酸与枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis natto)IAM1212同源性最高。SDS-PAGE分析显示,As-Amy基因在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活力较原菌株XM-1提高了2.7倍,表达蛋白分子质量大小与预测值相符。     

重组枯草芽孢杆菌PaE菌株的构建及碳代谢阻遏效应研究

通过基因重组的方法,将枯草芽孢杆菌168的α-淀粉酶基因amyE（除掉启动子）整合在Paxo1质粒上,然后将重组表达质粒Paxo1-amyE导入枯草芽孢杆菌168菌株基因组中的半乳糖苷酶基因lacZ位点。通过转化筛选和重组基因分析,获得含有重组α-淀粉酶基因的工程菌株PaE。经过添加4 种不同的碳源发酵实验检测,在外加2 g/100 mL木糖诱导的情况下,重组菌株的α-淀粉酶产量均有增加。而且重组菌株在一定程度上能够克服葡萄糖等还原性糖引起的碳代谢阻遏现象,提高了α-淀粉酶产量。     

Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中分泌途径的鉴定及其分泌能力的提高

食品安全（GRAS）菌株枯草芽孢杆菌由于其具有良好的分泌表达能力及易于基因工程操作等特性被广泛用作外源蛋白质的表达菌株。枯草芽孢杆菌中蛋白质的分泌大多依赖于信号肽介导的Sec分泌途径（General secretion pathway）和Tat分泌途径（Twin-arginine translocation pathway）。在本研究中,通过信号肽预测、蛋白质N端测序等手段发现来自于Pyrococcus yayanosii L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌并不依赖信号肽,该酶通过非经典蛋白质分泌途径（non-classical protein secretion pathway）进行分泌。通过信号肽筛选,发现最适合该酶在枯草芽孢杆菌中表达的信号肽为Tat分泌途径信号肽SP_phoD,并通过共表达分子伴侣PrsA的方式将该L-天冬酰胺酶的分泌量提高了72.11%。     

嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ的高效分泌表达及其酶学性质

本文探索了嗜热酸性普鲁兰水解酶Ⅲ Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中的高效分泌表达条件,并对重组Tk-PUL的酶学性质进行了初步研究。通过构建Tk-PUL分泌表达信号肽筛选库,并结合高通量筛选方法,确定引导Tk-PUL在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达的信号肽。结果表明,在信号肽AmyE的引导下,重组Tk-PUL在枯草芽孢杆菌表达系统中高效分泌表达。Tk-PUL属于单结构域双功能酶,同时具有α-淀粉酶活性和普鲁兰酶活性。重组Tk-PUL的α-淀粉酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为54.08 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。重组Tk-PUL的普鲁兰酶活性的最适反应pH为4.5,最适反应温度为100℃,对应的绝对酶活为110.39 U/mg,于100℃的半衰期约为2 h。本研究为Tk-PUL在淀粉酶法制糖工业中的应用奠定了基础。     

重组普鲁兰酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

普鲁兰酶可特异性地水解支链淀粉得到直链淀粉,因而在淀粉加工过程中具有重要的应用。本研究从Bacillus naganoensis ATCC53909基因组中克隆了普鲁兰酶基因pul,并克隆到大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体p BE中,构建表达载体p BE-pul。在此基础上,将来源于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及解淀粉芽孢杆菌中的17个高表达基因的启动子分别克隆到表达载体p BE-pul中,并转化至Bacillus subtilis ATCC6051?10,成功构建了十七株含有不同启动子介导普鲁兰酶分泌表达的重组菌株。对重组菌株的分泌表达比较发现,启动子P43和Pspov G介导的普鲁兰酶活性明显优于其他启动子,其中Pspov G介导的普鲁兰酶活性更高。同时,还使用了启动子Pspov G介导N端的108个氨基酸缺失的pul324突变体进行分泌表达。通过对17种启动子的比较和两个普鲁兰酶基因的比较,本研究构建的一株重组菌株的普鲁兰酶的表达更为高效,其活性高达389.85 U/mL,后者显著高于现有的相关报道。     

α-淀粉酶在不同地衣芽孢杆菌宿主菌中分泌表达的对比分析

研究不同地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)宿主菌对α-淀粉酶分泌表达的影响。以Bacillus subtilis的P43启动子,B.licheniformis WX-02α-淀粉酶基因的信号肽、编码区和终止子序列为表达原件,构建了α-淀粉酶分泌表达载体pP43SAT。将pP43SAT分别转入3株B.licheniformis宿主菌:WX-02(ΔamyL)、BL9和BL10,获得3株α-淀粉酶基因工程菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)、BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT),并将构建的3株工程菌进行发酵对比分析。BL9(pP43SAT)和BL10(pP43SAT)的淀粉酶发酵活力分别达到94.01 U/mL和101.94 U/mL,比原始宿主菌WX-02(ΔamyL,pP43SAT)分别提高了21%和31%,这说明BL9和BL10新型宿主菌有利于淀粉酶的分泌表达。本研究证明多蛋白酶基因缺失可显著提高α-淀粉酶的表达,为α-淀粉酶的高效表达提供了新型宿主菌和新策略。     

嗜糖假单胞菌麦芽四糖淀粉酶的枯草芽孢杆菌表达及酶学性质分析

麦芽四糖淀粉酶是淀粉酶中第3种外切型酶,可以顺序地从淀粉非还原性末端依次切割第4个α-1,4糖苷键,产物为麦芽四糖,广泛应用于食品、医疗保健等领域。该研究采用含有P43启动子和SacB信号肽的pWB980枯草芽孢杆菌表达载体,连接嗜糖假单胞菌来源的麦芽四糖淀粉酶基因,获得了重组菌pWB980-G4/1A747,实现了麦芽四糖淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的外分泌表达,并具有生物学活性。对表达产物进行酶学性质分析,结果表明麦芽四糖淀粉酶可广泛作用于7种不同来源的淀粉,生成单一产物麦芽四糖。最适反应温度为50℃,最适pH为7.0。进一步对pWB980-G4/1A747菌株进行发酵条件优化,得到其最佳活化时间为5 h,接种量为5%(v/v),通气量为20 mL/150 mL,培养时间为24 h,培养温度为37℃。     

古细菌Pyrococcus furiosus高嗜热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的分泌表达

该文将大肠杆菌表达载体pKK223—3中含tac启动子的片段以BamH I、EcoR I酶切后接入表达载体pET28a中，构建成新的表达载体pE tac，通过PCR扩增获得p.furiosus胞外α-淀粉酶完整结构基因，接入PEtac中，转化大肠杆菌JM109。在IPTG诱导下，转化子周质中能测出明显酶活，证明Pyrococcus furiosus的胞外α-淀粉酶能在自身信号肽引导下分泌到大肠杆菌细胞周质中。重组酶最适pH为4．5，最适温度为95℃，重组酶经121℃保温1h，酶活仍能保持50%以上，性质与由p.furiosus自身分泌的胞外α-淀粉酶相似。     

信号肽编码序列库的构建及耐热乳糖酶的分泌

为了实现来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,建立一种较简便的方法筛选能够分泌该酶的信号肽,即针对11种信号肤构建信号肽编码序列库,采用随机筛选方法得到合适的信号肽,构建相应的分泌表达载体和重组表达菌株.结果表明,通过信号肽随机筛选方法获得的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE信号肽能够有效引导该酶的细胞外分泌,重组菌株摇瓶培养16h后,上清液中积累的耐热β-半乳糖苷酶活力达到64.02 U/mL,占该酶所表达的总酶活力的29.6％.该信号肽筛选方法可以为微生物蛋白质分泌过程中的信号肽快速选择和优化提供参考.     

基于角质酶共表达策略的大肠杆菌胞外生产耐高温α-淀粉酶及其发酵条件优化

在前期工作中通过分子改造提高了来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶在高温酸性条件下的稳定性,同时改良了催化效率。为了实现α-淀粉酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的胞外高效表达,作者尝试采用共表达嗜热放线菌(Thermobifida fusca)角质酶来增强大肠杆菌膜透性,同时优化诱导策略以提高重组α-淀粉酶的胞外表达。首先构建了能同时表达角质酶和α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pETDuet-amy-cutinase,并将此菌株与能单独表达α-淀粉酶的工程菌BL21(DE3)/pET-20b-amy进行摇瓶和3 L发酵罐的产酶发酵对比。结果显示,共表达菌株在胞外产酶方面具有明显的优势。进一步对共表达菌株的诱导条件进行优化,在32℃、诱导剂为0.15μmol/L IPTG与0.5 g/(L·h)乳糖条件下,发酵32 h后胞外α-淀粉酶最高酶活力可达6.05×10~4U/m L,是单表达菌株摇瓶发酵水平的28.3倍。此时胞外重组α-淀粉酶质量浓度为8.92 g/L,重组蛋白质的分泌效率为93.2%。     

信号肽突变促进透明质酸酶分泌的高通量筛选方法

为了增强透明质酸酶在微生物胞外的分泌表达,本文采用强组成型启动子P43,在枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168基因组中整合表达水蛭来源的透明质酸酶,并利用RECODE突变技术构建信号肽突变库,通过高通量96微孔板初筛,将1000株突变株中胞外酶活提高50%以上的20株突变体进行摇瓶复筛,最终获得了三株胞外酶活显著提升的突变株B. subtilis MspLHyalA-C(比野生型LHyal酶活提高55.50%-66.85%),摇瓶中粗酶活最高达到6.04×104 U/mL,为透明质酸酶的定向进化提供了可行性方案。