环介导等温扩增技术快速检测椰毒假单胞菌的研究

建立环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测椰毒假单胞菌的方法。根据公布的椰毒假单胞菌16S～23SrRNA基因序列设计引物,建立了LAMP反应体系,在此基础上检测了蜡样芽孢杆菌菌液和人工污染蜡样芽孢杆菌的银耳样品,并将LAMP法与PCR法进行比较。结果表明,LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,椰毒假单胞菌的检出限为5.4CFU/mL,是PCR方法检测灵敏度的1000倍,人工污染银耳样品中的椰毒假单胞菌的检出限为76CFU/g,样品中椰毒假单胞菌的检测过程(包括DNA提取、LAMP和电泳)可在2h内完成,因此LAMP可以简便快速有效地检测食品中的椰毒假单胞菌。      

实时荧光环介导等温扩增技术检测猪肉中的假单胞菌

根据假单胞菌16S rDNA基因序列设计引物,并向反应体系中加入饱和型核酸染料Eva Green,利用实时荧光检测仪,建立假单胞菌属实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)。研究中对62株假单胞菌的16S rDNA基因通过DNAMAN软件进行序列比对后,针对共有片段设计扩增引物。对扩增体系进行了优化,优化结果经电泳鉴定。通过12株假单胞菌和23株非假单胞菌进行特异性验证,并比较了实时荧光LAMP与普通LAMP的灵敏度,对人工污染样品的检出限进行了测定。结果表明,特异性验证中12株假单胞菌为阳性,23株非假单胞菌为阴性。实时荧光LAMP检测纯菌的灵敏度为36 CFU/mL,是普通LAMP灵敏度的10倍。人工污染样品的检出限为1.73×10~3 CFU/g。本研究中建立了一种检测冷鲜猪肉中假单胞菌属的方法,实现了多个菌种的同时检测,避免了单一菌种检测的局限性,该方法快速、准确、灵敏度高,可在2 h内完成冷鲜猪肉中假单胞菌的检测。     

实时荧光环介导等温扩增检测铜绿假单胞菌

目的建立一种实时荧光与环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)相结合的铜绿假单胞菌检测方法。方法利用铜绿假单胞菌的外毒素A基因(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, PEA)序列,设计LAMP引物,对该方法的特异性、灵敏度及其在人工污染矿泉水中的检出限进行评价。结果该方法与其他菌株无交叉反应,特异性强,对纯菌液和人工污染矿泉水的检出限均可达到5.2 CFU/mL。结论该方法快速、灵敏、操作简便,为水样中铜绿假单胞菌的检测提供了一种有效的手段。     

环介导等温扩增技术检测食品中铜绿假单胞菌

建立食品中铜绿假单胞菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。利用铜绿假单胞菌外毒素A(PEA)基因序列,设计3对铜绿假单胞菌LAMP检测特异性引物,用36株铜绿假单胞菌,14株近源菌验证方法的特异性。建立的LAMP方法特异性好,灵敏度达到2.2 cfu/100 g~3.5 cfu/100 g。建立的食品中铜绿假单胞菌LAMP检测方法特异性好,灵敏度高,适用于的检测食品中的铜绿假单胞菌。     

环介导等温扩增技术快速检测沙门菌

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种在等温条件下高特异、高效、快速地扩增靶序列的DNA扩增新技术.以沙门菌(Salmonella spp.)为研究对象,根据其特异性的invA基因,设计了一套特异性引物对该基因进行了LAMP,同时优化了其反应条件,建立了沙门菌的LAMP快速检测技术.结果表明,LAMP的最佳反应条件为外引物浓度5 pmol/L、内引物浓度40pmol/L,Mg2 浓度6mmol/L,dNTP浓度0.8mmol/L,甜菜碱浓度0.8mmol/L,Bst DNA聚合酶8u,反应温度63℃,反应时间1 h.在此条件下,LAMP检测沙门菌DNA的敏感度达10fg/反应,且与其他常见的细菌无交叉反应.其对牛奶样品的检出量为102cfu/mL,适合于食品中污染沙门菌的快速检测.     

核酸等温环介导荧光检测法检测包装饮用水中的铜绿假单胞菌

目的:通过建立核酸等温环介导扩增荧光法检测包装饮用水中铜绿假单胞菌的快速检测方法,提高企业的检测效率。方法:根据OprL基因特异序列设计引物,建立LAMP检测方法,进行等温环介导荧光PCR重复性、特异性、灵敏度以及人工污染样本检测并和传统方法对比。结果:LAMP法具有良好的重复性、特异性强,该法的最低检测限为10³ cfu/mL,相对传统方法检出率高,用时由2 d缩短至18 h。结论:研究建立的核酸等温环介导荧光检测法快速、简便、灵敏、准确,可为监管部门及饮用水生产企业提供一种高效、准确的检测手段。     

反转录-环介导等温扩增技术快速检测志贺氏菌

建立了反转录-环介导等温扩增技术的志贺氏菌快速检测方法。针对志贺氏菌特异保守基因ipa H设计多套引物,建立优化了的反应体系,并评价其准确性、特异性、灵敏度。以人工污染脱脂乳样品比较RT-LAMP与RT-PCR的灵敏度。结果表明,在65℃等温条件下,RT-LAMP反应可在30 min内完成。在活菌/损伤菌模型中,该方法表现出比国标法更好的准确性。在23株细菌标准菌株中仅对4株志贺氏菌有特异性检出。志贺氏菌RNA模板的检测灵敏度为7 fg/μL。人工污染脱脂乳样品检测灵敏度达到40 CFU/g,比RT-PCR方法高出2个数量级。表明所建立的志贺氏菌RT-LAMP扩增方法可以准确的检测志贺氏菌,同时具有快速、特异、灵敏的优势,可用于志贺氏菌的快速筛查和现场监控。     

重组酶介导等温扩增法检测食品中铜绿假单胞菌

目的 建立重组酶介导等温扩增（Recombinase-aided amplification,RAA）法,快速、灵敏、特异检测食品中铜绿假单胞菌的分析方法。方法 针对铜绿假单胞菌lasB基因的特异性保守区域,设计RAA特异性引物和exo探针,筛选出最优组合;对提取的目标基因组DNA进行检测,确定方法的特异性和灵敏度,并通过人工污染实验,比对不同检测方法对食品样品的检出限。结果 建立的铜绿假单胞菌lasB基因RAA检测方法特异性良好,仅对铜绿假单胞菌有扩增曲线,对其他致病菌无交叉反应;方法对纯菌液的灵敏度为1.7 pg/μL。人工污染实验表明,方法对肉类样品中铜绿假单胞菌的检出限与传统方法一致,达1.0×103 CFU/mL;RAA方法检测时间仅需20min。结论 本研究建立的铜绿假单胞菌实时荧光RAA检测方法特异性强、灵敏度高、反应时间短,可用于食品中铜绿假单胞菌的快速检测。     

椰毒假单胞菌酵米面亚种检测方法研究进展

近年来,由椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的食物中毒事件常有发生,其毒素米酵菌酸的致病性极强,死亡率高,引起人们的高度关注。本文主要从国标法中的微生物培养技术、基因测序技术、PCR技术(包含常规PCR和实时荧光PCR技术)、环介导等温扩增技术及微滴数字PCR技术等方面总结椰毒假单胞菌酵米面亚种的检测方法,并对该菌未来的研究方向进行展望。     

环介导等温扩增技术快速检测食品中变形杆菌的研究

采用环介导等温扩增(LAMP)技术,快速检测食品中的变形杆菌。以变形杆菌(CMCC49027)的atpD基因作为靶序列,设计内、外引物,通过肉眼观察白色沉淀,判断检测结果。共对11株致病菌进行特异性实验。结果表明,变形杆菌为阳性,其他10株菌为阴性。采用FTA滤膜制备模板进行LAMP反应,其方法的灵敏度为6.4×102CFU/mL。利用LAMP技术直接检测人工污染的肉制品中的变形杆菌,其检出限为3.6×103CFU/g。本实验所建立的快速检测变形杆菌的LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,能够满足变形杆菌快速检测的需要。      

Rapid and sensitive detection of Pseudomonas aeruginosa in bottled water by loop-mediated isothermal amplification

A loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the rapid detection of Pseudomonas aeruginosa in bottled water was developed and evaluated. Four primers, including two outer primers and two inner primers, were specially designed by targeting the ecfX gene. The LAMP assay showed high specificity, with no false-positive or false-negative results among the 108 bacterial strains tested, including 81 strains of P. aeruginosa. The detection limit in pure culture was 15.7 CFU/mL, which is approximately 100-fold more sensitive than that of ecfX-PCR. In artificially contaminated water samples spiked with low level (3.1 CFU/250 mL) of P. aeruginosa, the LAMP assay could detect the target organisms accurately after 10 h of enrichment, in contrast to 12 h of enrichment for ecfX-PCR. In the case of bottled water samples, 9.17 % (10/109) of the samples were found to be positive by LAMP, which was in accordance with the results from GB 8538-2008 method. The LAMP assay established in this study is a simple, sensitive, and rapid protocol for the detection of P. aeruginosa. It provides an important diagnostic tool for the drinking water produce industry and regulatory agencies to better control potential risks associated with consumption of bottled water.     

环介导等温扩增技术快速检测双歧杆菌属细菌

目的建立一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术快速检测双歧杆菌属细菌的方法。方法针对双歧杆菌属细菌16S rDNA基因特异性区段设计LAMP引物,根据反应体系的颜色或浊度变化特异性地检测样品中双歧杆菌属细菌。结果对5株双岐杆菌属细菌和19株非双歧杆菌属细菌进行特异性和非特异检测,结果均为100%。该检测可在60 min内完成,双歧杆菌属细菌DNA的检测限为16.1±8.2 pg/μL,对双歧杆菌属细菌菌体的检测限为0.1 CFU/mL。结论LAMP方法可作为传统国家标准检测方法的辅助手段,有效检测食品、保健食品和药品中双歧杆菌属细菌DNA的存在。     

环介导等温扩增技术快速检测食品过敏原牡蛎成分

目的建立环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法快速检测食品中的过敏原牡蛎成分。方法根据国家生物技术信息中心的牡蛎线粒体序列,通过Primer Explorer version 5.0软件设计引物并筛选出LAMP特异性扩增引物。并进一步对反应体系优化,对该方法的灵敏度、特异性以及稳定性进行验证。对10种牡蛎阳性样品、14种阴性样品、4类牡蛎相关食品进行检测。结果该方法可以检测出含牡蛎成分0.1%, DNA浓度为0.01 ng/μL的样品。在实验时间上大幅缩短,反应可在25～45 min内结束,并且可以在微量体系下完成,对于食品相关产品的检出率为100%。结论该方法操作简单、成本较低、特异性高、灵敏度好,适用于食品中过敏原牡蛎成分的检测。     

环介导等温扩增法快速检测食源性致病菌

目的考察环介导等温扩增技术在食源性致病菌快速检测中的应用效果。方法待检样品按照GB4789系列标准进行前增菌后,提取核酸进行致病菌检测。结果食品中6种常见的致病菌:金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、单增李斯特菌、副溶血弧菌和大肠杆菌O157检测阳性符合率100%,阴性符合率100%,检出限介于3.0×10~3～1.1×10~4 CFU/25 g,前增菌时间最快5h,检测时间为2d。结论环介导等温扩增技术具有检出限低、特异性好、检测速度快等优点,能较好地满足进出口食品中致病菌快速检测的要求。     

环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌

利用环介导等温扩增方法的快速、简便等优点,建立一种检测乳中阪崎肠杆菌的方法。以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因,设计特异性引物。优化并建立LAMP检测乳中阪崎肠杆菌的方法。结果表明,LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为3.7×101cfu/mL,其灵敏度是PCR方法的10倍。人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为4.3×101cfu/mL。对23株致病菌进行特异性实验,特异性良好。该方法具有特异性强、灵敏度高、设备简便、耗时短等优点,在食品检测中具有良好的应用前景。      

环介导等温扩增技术快速检测食品中的耐热芽孢菌

针对食品中的好热黄无氧芽孢菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等耐热芽孢菌,以spo0A基因部分序列为靶基因,设计了一套引物,能够同时对这3种菌进行环介导等温扩增(LAMP)检测,扩增只需要60min。该法快速并具有良好的特异性,灵敏度可达到8cfu/mL,是普通PCR的10倍。DNaseI的使用与LAMP结合,可有效降解死菌游离DNA,消除其影响。结果表明,该方法用于奶粉及罐头制品中耐热芽孢菌的检测,具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点,在食品微生物检测中拥有广阔的前景。     

环介导等温扩增技术检测酸奶中嗜酸乳杆菌

目的建立环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测酸奶中嗜酸乳杆菌。方法以嗜酸乳杆菌16S r RNA保守区的基因序列为靶序列设计引物,优化建立LAMP反应体系和程序,并研究引物的特异性,同时确定嗜酸乳杆菌的灵敏度和检出限。结果本方法可通过凝胶电泳和离心后焦磷酸镁白色沉淀检测反应结果,检测时间为5.5 h,灵敏度为62 CFU/m L,人工污染酸奶样品的检出限为120 CFU/m L,12株非嗜酸乳杆菌细菌非特异检测结果均为100%。结论该方法灵敏性好、特异性强、操作简单、耗时短,可适合于酸奶中的嗜酸乳杆菌的快速测定。     

环介导等温扩增法快速检测乳中阪崎肠杆菌

利用环介导等温扩增方法的快速、简便等优点,建立一种检测乳中阪崎肠杆菌的方法.以阪崎肠杆菌的OmpA序列为靶基因,设计特异性引物.优化并建立LAMP检测乳中阪崎肠杆菌的方法.结果表明,LAMP检测阪崎肠杆菌纯培养物的灵敏度为3.7×101cfu/mL,其灵敏度是PCR方法的10倍.人工污染阪崎肠杆菌灭菌乳的检测限为4.3×101 cfu/mL.对23株致病菌进行特异性实验,特异性良好.该方法具有特异性强、灵敏度高、设备简便、耗时短等优点,在食品检测中具有良好的应用前景.     

Rapid detection of food-borne Listeria monocytogenes by real-time quantitative loop-mediated isothermal amplification

The purpose of this study was to develop a real-time quantitative loop-mediated isothermal amplication (LAMP) method for the rapid, sensitive, and convenient detection of Listeria monocytogenes in food. The LAMP method could amplify the hlyA gene of L. monocytogenes successfully at 63°C with a loopamp real-time turbidimeter. The detection limits of the LAMP for hlyA gene were 6 colony forming units (CFU)/tube. A standard curve was generated for L. monocytogenes LAMP by plotting the graph based different log CFU values of L. monocytogenes and time of positivity through real-time monitoring of the amplication. Then, the LAMP method was employed to test 94 retail food samples effectively. Sensitivity in detection of L. monocytogenes by the LAMP was higher than that of PCR and none of the conventional methodpositive samples was missed by the LAMP method.