植物细胞表达人胰岛素的载体构建

目的构建人胰岛素的植物细胞表达载体。方法设计多对引物,通过PCR反应合成霍乱毒素B亚单位(CTB)基因和不带C肽的人胰岛素基因。将霍乱毒素B亚单位(CTB)基因与这种不带C肽的人胰岛素基因融合后,插入克隆载体,然后用BamHⅠ和SacⅠ进行酶切,并将酶切的融合基因片段连接在植物表达载体pBI121上,最后用BamHⅠ和SacⅠ进行酶切鉴定。结果测序结果表明,PCR扩增的目的基因顺序与设计完全一致,并构建了克隆载体和植物表达载体。植物表达载体经酶切后鉴定,所含基因片段大小与预期相符。结论已成功地构建了人胰岛素基因的植物细胞表达载体。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达

目的提高乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)在人参愈伤组织细胞中的表达。方法构建一种植物细胞表达载体pBIBeo,该载体携带CaMV 35S双增强启动子和TMV(U1株)翻译增强子。用pBIBeo转化的农杆菌LBA4404与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞团PBIBeo,连续继代培养选育出用于植物源口服乙肝疫苗生产的高产细胞株。提取基因组DNA和mRNA,进行PCR和RT-PCR鉴定,Western blot鉴定HBsAg的特异性,电镜下观察纯化抗原颗粒大小,并以ELISA检测HBsAg的表达水平。结果转化的人参细胞基因组DNA进行PCR反应,得到约700 bp的启动子基因片段。提取mRNA进行RT-PCR反应,得到约700 bp的HBsAg基因片段。Western blot分析可见相对分子质量为24 000的特异性条带。亲和层析纯化细胞表达的HBsAg抗原,电镜观察可见平均直径为32 nm的颗粒。ELISA检测结果表明pBIBeo转化细胞株HBsAg表达量比pBIBSa转化细胞株提高1~2倍。结论人参细胞基因组已经整合了目的基因并稳定高效表达。     

百日咳毒素S1亚单位突变体在大肠杆菌中的表达及纯化

目的克隆百日咳毒素S1亚单位,获得其突变体(S1/9K-129G,rS1),构建原核表达系统,并鉴定融合蛋白的特异性。方法采用PCR和重叠延伸扩增得到突变体,将其与pMD18-T连接,转化至大肠杆菌DH5α,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-T-rS1,经双酶切得到rS1活性结构域编码片段。将其插入pQE-30载体中,转化大肠杆菌M15株,经IPTG诱导表达。表达产物经镍离子柱纯化,并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果PCR及重叠延伸获得了约700bp的目的基因片段,并获得阳性重组表达载体克隆,表达产物为相对分子质量27000左右的蛋白,Western blot检测能与兔抗百日咳毒素多价抗血清发生反应。结论成功表达并纯化了百日咳毒素S1亚单位突变体,为研制百日咳疫苗候补抗原的相关分子免疫学研究奠定了基础。     

牛Ⅱ型链球菌vanB2基因真核表达质粒的构建及其在宫颈癌HeLa细胞中的表达

目的构建牛Ⅱ型链球菌(Streptococcus bovis biotypeⅡ)van B2基因真核表达质粒,并在宫颈癌HeLa细胞中进行表达。方法以牛Ⅱ型链球菌基因组为模板,采用PCR法扩增van B2基因,克隆至真核表达载体pVAX-1中,构建重组表达质粒pVAX-1-van B2。采用FuGENE HD Transfection Reagent试剂盒将重组表达质粒转染HeLa细胞,转染48 h后,RT-PCR法检测转染细胞中van B2基因mRNA的转录;间接免疫荧光法和Western blot法检测转染细胞中van B2蛋白的表达。结果重组表达质粒pVAX-1-van B2经双酶切及测序鉴定构建正确;重组表达质粒转染HeLa细胞48 h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,RT-PCR及Western blot分析分别可见570 bp及相对分子质量20 900的目的条带。结论成功构建了牛Ⅱ型链球菌van B2基因的真核重组表达质粒,并在HeLa细胞中成功表达。本实验为进一步研究牛Ⅱ型链球菌对抗生素的耐药性机制及其与van B2基因的相关性奠定了基础。     

重组人凝血因子Ⅶ在Flp-In-CHO细胞中的表达及鉴定

目的利用Flp/FRT位点特异性重组技术,在Flp-In-CHO细胞中表达重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ),并进行鉴定。方法用限制性内切酶EcoRⅠ和EcoRⅤ分别双酶切质粒pT-FⅦ与表达载体pcDNA5/FRT/TO,将回收的目的基因片段和载体片段连接,构建重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ,并与辅助质粒pOG44共转染Flp-In-CHO细胞,经400μg/ml潮霉素B压力筛选,获得抗性细胞株。采用PCR、RT-PCR、Western blot和PT等方法对筛选出的细胞株分别进行基因组水平、mRNA水平、表达水平和蛋白活性的鉴定。结果重组表达质粒pcDNA5/FRT/TO-FⅦ经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确;筛选出9株抗性细胞;外源基因FⅦ定点整合到Flp-In-CHO细胞基因组中并得到表达;重组蛋白表现出与血浆FⅦ相一致的促凝活性。结论利用位点特异性表达系统Flp/FRT,在Flp-In-CHO细胞中成功表达了hFⅦ,为其制备和纯化奠定了基础。     

信号调节蛋白-α基因真核表达质粒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建信号调节蛋白-α(signal regulatory protein-α,SIRP-α)基因真核表达质粒,并于A549细胞中进行表达。方法提取Hep G2细胞总RNA,RT-PCR扩增SIRP-α基因片段,克隆至真核表达载体pc DNA3.1(+)-EGFP中,构建真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP。将重组表达质粒转染A549细胞,转染24 h后,荧光显微镜下观察转染情况;转染48 h后,RT-PCR检测SIRP-α基因的转录水平;转染72 h后,Western blot法检测SIRP-α蛋白的表达。结果经双酶切和测序鉴定真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP构建正确;转染pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP的A549细胞于荧光显微镜下可见绿色荧光;RT-PCR检测结果可见243 bp目的条带,Western blot检测显示SIRP-α存在。结论成功构建了真核表达质粒pc DNA3.1(+)-SIRP-α/EGFP,并于A549细胞中有效表达,为进一步研究SIRP-α与肺癌的相关性奠定了基础。     

小鼠MUC1基因的克隆及其在大肠杆菌DH5α中的表达

目的构建表达小鼠MUC1基因的工程菌,并纯化重组小鼠MUC1融合蛋白。方法通过RT-PCR扩增小鼠MUC1基因片段,连入pMAL-p2原核表达载体,并转化大肠杆菌DH5,αIPTG诱导表达,经Western blot鉴定,Amylose Resin亲和层析纯化。结果获得了小鼠MUC1 708bp DNA片段,并构建了pMAL-mMUC1表达载体。表达产物相对分子质量约为67000,经Western blot鉴定,与兔抗MBP多克隆抗体产生特异性反应。纯化的融合蛋白在SDS-PAGE图谱上呈单一条带。结论成功构建了表达小鼠MUC1蛋白的工程菌。     

颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达

目的构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达。方法经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达。结果融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267bp的目的基因片段。结论已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白。     

牛干扰素γ蛋白在Vero细胞中的表达及其抗病毒活性

目的在Vero细胞中表达牛干扰素γ基因,并对其抗病毒活性进行鉴定。方法将牛干扰素γ全基因克隆至pcDNA3.1(+)载体,构建重组表达质粒,经PCR及双酶切鉴定,将鉴定正确的阳性质粒通过脂质体法转染Vero细胞,分别采用间接免疫荧光和Western blot法检测细胞转染效率和干扰素γ蛋白的表达,采用细胞病变抑制试验检测其抗病毒活性。结果间接免疫荧光显示绿色荧光,表明牛干扰素γ蛋白在Vero细胞中得到表达,转染效率约为50%;Western blot检测可见相对分子质量约为22 000的目的条带,进一步验证了该蛋白的表达;细胞病变抑制试验显示细胞病变明显减少,表明表达的干扰素γ蛋白具有明显的抗病毒活性。结论成功在Vero细胞中表达了牛干扰素γ蛋白,其具有明显的抗病毒作用。     

MafA基因真核表达质粒的构建及其在人肝癌细胞HePG-2中的表达和作用

目的构建胰岛素启动子肌腱膜的纤维肉瘤肿瘤基因同系物A(MafA)基因的真核表达质粒,并观察MafA基因在人肝癌细胞HePG-2中的表达及其作用,为糖尿病基因治疗的研究奠定基础。方法提取小鼠胰腺组织总RNA,经RT-PCR扩增MafA基因片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N2和pEGFP-C1中。用脂质体将重组表达质粒转染至人肝癌细胞HePG-2中,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR检测转染细胞中MafA和insulinⅡ基因的转录水平,Western blot检测融合蛋白EGFP-MafA的表达。结果重组表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA经PCR、双酶切和测序证明构建正确;重组质粒转染的HePG-2细胞有绿色荧光蛋白表达;经RT-PCR可检测到MafA基因表达,但未检测到insulinⅡ基因表达;经Westernblot检测,在相对分子质量约70 000处可见特异性反应条带。结论已成功构建了MafA基因真核表达质粒pEGFP-N2/MafA和pEGFP-C1/MafA,以其转染的HePG-2细胞可表达MafA基因,并翻译成蛋白,但未表达insulinⅡ基因。     

乙酰肝素酶大亚基在毕赤酵母中的表达

目的构建乙酰肝素酶(HPA)大亚基片段真核表达质粒,并在毕赤酵母中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的HPA大亚基基因序列设计引物,PCR方法扩增肝素酶基因,构建毕赤酵母真核表达质粒pPICZαA-HPA。电击穿孔法转化感受态毕赤酵母SDM1168,斑点免疫印迹法筛选重组菌株,PCR法鉴定阳性克隆。甲醇诱导表达重组蛋白,Western blot鉴定表达产物。结果构建的重组真核表达质粒经双酶切及测序鉴定证明构建正确;斑点免疫印迹法筛选出的9个单菌落经PCR扩增,均可见1161bp的目的基因条带;表达产物经Western blot分析,具有良好的反应原性,表达量约为5μg/L。结论已成功构建了HPA大亚基片段真核表达质粒pPICZαA-HPA,并在毕赤酵母SDM1168中分泌表达了HPA大亚基。     

重组猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的原核表达及鉴定

目的原核表达猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白,并对其反应原性进行分析。方法通过PCR从已构建的猪源戊型肝炎病毒全基因克隆扩增ORF2编码382~674位氨基酸序列的基因片段,将扩增产物插入到pMD18-T载体中,亚克隆至原核表达载体pET28a(+),构建pET28a-293表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA层析柱纯化后,进行SDS-PAGE、Western blot及ELISA鉴定。结果成功扩增到904bp的目的基因。重组载体pET28a-293经双酶切鉴定及序列测定,证实构建正确。SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量与预期相符,表达量可占菌体总蛋白的66.15%。Western blot分析表明目的蛋白具有较好的反应原性。ELISA试验证实目的蛋白能与阳性猪源和标准HEV血清发生反应。结论已成功构建了猪源戊型肝炎病毒衣壳蛋白的pET28a-293原核表达载体,并得到了有效表达,为进一步建立猪源戊型肝炎的诊断方法奠定基础。     

百日咳毒素S1亚基片段在大肠杆菌中的表达

目的构建百日咳毒素(PT)S1亚基片段原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达重组蛋白。方法根据GenBank中登录的百日咳毒素S1亚基基因序列,人工合成密码子优化的S1基因,利用重叠PCR技术将S1基因上的两段DNA序列拼接在一起,形成一个新的基因序列S1′。将该序列与7ZTS表达载体连接,构建重组原核表达质粒7ZTS-S1′,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。结果S1′基因经PCR鉴定及测序证明与预期相符;重组表达质粒经双酶切鉴定证明构建正确;表达蛋白的相对分子质量约17400,表达量约占菌体总蛋白的8%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建百日咳毒素S1亚基片段重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了重组蛋白,为PT单抗及其检测试剂盒的研制奠定了基础。     

弓形虫亲环蛋白基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)亲环蛋白(Cyclophilin,CyP)基因。方法收集、纯化Rh株弓形虫速殖子,提取总RNA,应用RT-PCR技术扩增TgCyP基因,插入原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-TgCyP,转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果测序结果与GenBank中登录的基因序列同源性为100%,重组表达质粒pET-28a-TgCyP经PCR及双酶切鉴定证明构建正确。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白的相对分子质量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的40%,Western blot显示其能被鼠抗弓形虫免疫血清识别。结论已在E.coliBL21(DE3)中表达了Rh株TgCyP,其有望作为弓形虫疫苗的候选抗原。     

大肠癌相关基因PGDH原核表达质粒的构建及表达

目的构建15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达PGDH蛋白。方法以人正常大肠黏膜组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,转化E.coliDH5α,经温控诱导表达,并经Ni2+-NTA亲和层析纯化,目的蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果重组质粒pBV220-PGDH-His6经PCR及酶切鉴定,证明质粒构建正确。经温控诱导后,可表达出相对分子质量约为29 000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3 h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的30%。Western blot验证了表达蛋白的特异性。纯化后目的蛋白纯度大于95%。结论已成功构建PGDH原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了PGDH蛋白。     

人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因穿梭质粒的构建及表达

目的构建人幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中进行表达。方法PCR扩增幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI编码基因全长片段,克隆入pET32a(+)质粒,鉴定正确后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pJHSP70,构建分枝杆菌穿梭表达质粒pJHSP70-UreI,转化耻垢分枝杆菌,诱导表达后,进行SDS-PAGE和Western blot检测。结果从幽门螺杆菌基因组中扩增出585bp的UreI基因片段。重组质粒pJHSP70-UreI经酶切和PCR鉴定,与预期结果一致。目的蛋白表达量约占菌体总蛋白的18.5%,且具有良好的反应原性。结论已成功构建了幽门螺杆菌尿素通道蛋白UreI基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒,并在耻垢分枝杆菌中获得表达。     

梅毒螺旋体特异抗原TP0684的克隆和表达

目的克隆并表达梅毒螺旋体外膜蛋白TP0684,为研制早期诊断试剂盒提供依据。方法PCR法扩增TP0684编码基因。T-A克隆后构建表达质粒pET-22b(+)-TP0684,经酶切鉴定后,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Western blot鉴定。结果PCR法扩增出了1212bp的目的片段,原核表达质粒pET-22b(+)-TP0684酶切鉴定正确,测序结果与GenBank上公布的该基因的CDS序列完全一致。转化E.coli BL21(DE3)后,IPTG诱导目的蛋白表达率为25%,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量约43000,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TP0684重组蛋白具有良好的免疫反应性,为进一步研究梅毒血清学诊断试剂奠定了基础。     

梅毒螺旋体特异性抗原TpN47基因片段的克隆与表达

目的在大肠埃希菌中表达梅毒螺旋体(Tp)TpN47(68~410 aa)重组蛋白。方法采用PCR法从Tp全基因组中扩增TpN47(202~1230 bp)片段,T-A克隆后构建原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47,经酶切鉴定后转化EcoliBL21(DE3),IPTG诱导表达,表达产物经Ni2+亲和层析柱纯化,Western blot鉴定其免疫反应性。结果PCR法扩增出约1 000 bp的目的片段,原核表达质粒pET-22 b(+)-TpN47经酶切鉴定正确,表达的蛋白约占菌体总蛋白的43%,相对分子质量约为39 000,以包涵体形式存在。经纯化后蛋白纯度达95%以上,Western blot证实该蛋白能与梅毒患者阳性血清发生特异性反应。结论所表达的TpN47重组蛋白具有良好的免疫反应性,为开发临床检测效果更好的梅毒诊断试剂盒奠定了实验基础。