探索miR-145介导的黑青斑河鲀IFN-γ对MHC II的精细调控

哺乳类miR-145通过作用于MHC II的反式作用因子CIITA对MHC II的表达进行调控。为探讨在黑青斑河鲀中miR-145是否对CIITA基因存在直接调控作用,进而间接调控MHC II的表达,将黑青斑河鲀CIITA的3′非编码区(3′UTR)序列亚克隆至pMIR-Report载体中,通过双荧光素酶报告系统研究两者是否存在直接的靶标作用。结果表明:将miR-145类似物和构建的CIITA3′UTR载体共转染至Hela细胞后,荧光素酶活性没有出现预期的下调,反而出现上调;增大或减少miR-145的转染量,荧光素酶活性的变化幅度也会随之改变。将miR-145类似物和构建的CIITA3′UTR载体共转染至COS-7细胞,荧光素酶的活性没有改变。离体转染miR-145到河鲀原代脾细胞中,检测MHC II基因的表达水平也没有变化,表明miR-145确实对河鲀CIITA没有靶标作用。     

调节猪TNF-α表达的miRNAs鉴定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接构建猪TNF-α的萤光素酶表达质粒PGL3-TNF-α3'UTR。生物信息学预测miR-19a,miR-124,miR-130a,miR-301,miR-506等miRNAs均靶向猪TNF-α,将这些miRNA分别与PGL3-TNF-α3'UTR质粒共转到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对质粒荧光素酶活性的作用。结果发现miR-19a,miR-124和miR-130a均能够显著抑制萤光素酶的活性(P<0.01),为了验证这3个miRNA是否通过各自种子序列起调控作用,突变了PGL3-TNF-α3'UTR中这3个miRNA种子序列的结合位点,结果发现miRNAs对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用(P>0.05)。结果证明,miR-19a,miR-124和miR-130a与猪TNF-α均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制TNF-α的表达。     

斑马鱼miR-30e对血细胞生成的作用机制研究

microRNA(简写为miRNA)是一类内源基因编码的单链RNA分子,参与转录后基因的表达调控,在血液生成过程中起着重要作用。为研究miR-30e对鱼类血液生成的作用机制,以斑马鱼Danio rerio作为模式生物,针对青藏高原裂腹鱼血液组织中高表达的miR-30e,利用生物信息软件预测斑马鱼miR-30e的靶基因,构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的双荧光素酶报告质粒与斑马鱼miR-30e进行共转染,检测细胞双荧光素酶活性的变化;同时构建含斑马鱼ALAS2-3′UTR序列的绿色荧光蛋白质粒,与miR-30e共同显微注射斑马鱼胚胎,观察GFP荧光强度与蛋白表达量的变化。结果表明:斑马鱼胚胎在注射miR-30e模拟体48 h后,其血红蛋白表达明显减少;转染miR-30e的293T细胞双荧光素酶活性显著降低(P<0.05);斑马鱼胚胎注射miR-30e模拟体24 h后,其GFP荧光强度明显降低,且GFP蛋白表达量明显减少。研究表明,ALAS2基因是miR-30e的一个靶基因,miR-30e通过抑制ALAS2表达而抑制血红细胞的生成。     

miRNA-20a作为CHO-K1细胞抗凋亡调控靶标的研究

通过分析miRNA表达谱发现,miRNA-20a在凋亡CHO-K1细胞中的表达降低。通过构建稳定表达miRNA-20a的重组细胞株,分析该重组细胞的抗凋亡能力。分别构建携带miRNA-20a前体序列或反义序列的重组慢病毒,转染CHO-K1细胞,得到miRNA-20a功能获得或功能抑制的重组细胞。无血清过度消耗培养液应激环境下培养重组细胞,分析靶基因E2F1的表达水平,通过细胞活力和Caspase3/7活性分析评价细胞的抗凋亡能力。结果显示,miRNA-20a过表达的细胞株,E2F1的表达受到显著抑制,在无血清过度消耗的应激环境下,细胞活力显著提高,Caspase3/7活性降低。相反,miRNA-20a抑制表达的细胞株中,E2F1表达增加,而细胞活性显著降低,抗凋亡能力显著下降。上述结果提示,miRNA-20a有望作为哺乳动物宿主细胞的遗传重构靶标,构建耐受应激环境的抗凋亡细胞。     

重组人源性脂联素球状结构的表达、纯化与活性检测

目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd)基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测。方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd。运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性。结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性。结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础。     

灵芝孢子油抑制前列腺癌LNCaP细胞中AR激活及转录活性

目的:研究灵芝孢子油对双氰睾酮诱导的前列腺癌LNCaP增殖、雄激素受体AR的激活和转录活性及相关激酶的影响。方法:采用质粒转染、Western blot、CCK-8细胞增殖活性检测及双色荧光素酶报告基因活性等研究灵芝孢子油对雄激素依赖的前列腺癌LNCaP细胞的作用。结果:CCK-8检测显示灵芝孢子油明显降低DHT刺激的LNCaP细胞的增殖活性,同时,Western blot检测表明灵芝孢子油降低了DHT诱导的前列腺癌LNCaP细胞中AR和蛋白激酶D的磷酸化活性,而对其本底蛋白的表达水平无影响。荧光素酶报告基因活性检测进一步表明灵芝孢子油明显抑制DHT诱导的LNCaP细胞中AR的转录激活活性。结论:灵芝孢子油可能通过抑制AR的激活及其转录活性而抑制雄激素依赖的前列腺癌细胞的增殖。     

小鼠PGC-1α基因启动子的转录调控功能分析

目的克隆小鼠PGC-1α基因的启动子并分析其转录调控模式。方法设计引物,以小鼠肝脏组织DNA为模板,PCR扩增PGC-1α基因启动子区并克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,构建具有PGC-1α启动子转录活性的报告质粒pGL3-PGC-1α-Luc。通过特异性引物,引入替换碱基突变相关转录因子调控模序,构建点突变融合载体,并将其转染1c1c7及c2c12细胞系,检测荧光素酶的表达情况。结果构建的pGL3-PGC-1α-Luc系列报告质粒经过酶切鉴定及DNA测序分析都显示正确;PGC-1α基因启动子区域(-2533⁺78)具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低。结论成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域(-2533+78)具有较强的转录活性;突变失活PGC-1α基因启动子区域中的CRE及IRE反应原件导致转录活性明显降低。结论成功构建小鼠PGC-1α基因启动子报告质粒,PGC-1α基因上游区域(-2533⁺78)具有较强的启动子活性;启动子区域中的CRE和IRE反应原件为主要转录调控位点。     

经典Wnt信号途径在肺脏上皮细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用

目的:肺脏上皮细胞在抵抗外源微生物入侵中发挥着重要保护作用,最近研究揭示,在器官组织发育中发挥调控作用的经典Wnt信号具有免疫调节功能。因此,有必要研究肺脏上皮细胞A549中Wnt信号经典途径在抗结核分枝杆菌(Mtb)感染中的免疫调节作用。方法:用牛结核分枝杆菌卡介苗(BCG)刺激转入Wnt信号报告基因质粒BATflash的A549细胞,利用双荧光素酶报告系统、Western blot和ELISA方法分析细胞中Wnt信号经典途径主要相关信号因子和免疫反应炎症因子的表达变化。结果:BCG感染A549细胞后抑制了Wnt信号报告荧光素酶的活性,Western blot结果表明,随着细胞浆内磷酸化β-catenin含量增加,Wnt信号的抑制基因GSK3β和Axin2表达上调,而细胞核中的效应子β-catenin基因活性组分和下游转录因子TCF4与Lef-1的表达下调;BCG感染过表达β-catenin的细胞时导致IL-6、NF-κB、MyD88和TRAF6蛋白表达下调,但不影响TNF-α的表达。结论:肺脏上皮细胞在抗结核分枝杆菌感染过程中通过下调Wnt信号活性而抑制细胞中的MyD88/TRAF6/NF-κB信号通路来降低免疫反应以保护宿主细胞免受感染造成的免疫损伤。     

比较牛催乳素与生长激素对外源基因表达的影响

目的:用牛生长激素(bGH)和牛催乳素(bPRL)乳腺特异载体DNA分别转染携带人转铁蛋白(hTF)的转基因小鼠乳腺上皮细胞,比较这二种载体对外源基因(人转铁蛋白)的表达影响,为研制特异、高效表达外源蛋白转基因动物过程中载体的合理构建,提供有价值的理论和技术基础。方法:将构建β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL乳腺特异表达载体分别转染体外培养的转基因小鼠乳腺上皮细胞;并将转染pcDNA3.1质粒和未转染细胞作为对照,收集不同代数的细胞及上清液,用RT-PCR及Elisa法分析mRNA及蛋白,分析比较二者对hTF表达水平的影响。结果:RT-PCR显示人转铁蛋白转录电泳条带明显;Elisa表明二者均能提高hTF蛋白水平的表达。结论:首次应用牛生长激素和催乳素对外源基因表达影响作用进行比较研究;β-酪蛋白启动子(P1A3)调控的bGH和bPRL均能促进在乳腺上皮细胞水平上外源蛋白表达。因此,在研制转基因动物———乳腺生物反应器中,采用bGH和bPRL促进乳汁中外源蛋白特异、高效表达的载体都将是可选择的新技术途径。     

基于CRISPR/Cas9技术构建TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除人结直肠腺癌细胞Caco-2中的辣椒素受体基因TRPV1,构建TRPV1基因敲除的Caco-2稳定细胞系.使用CRISPR/Cas9在线靶点设计程序在TRPV1基因4个转录本的公共CDS区的第一个外显子DNA区域中设计一对gRNA,将gRNA构建到真核重组表达质粒的载体上,电转染待敲除细胞,经嘌呤毒素抗性筛选和基因测序获得敲除TRPV1基因的稳定细胞系.用Western Blot检测TRPV1基因蛋白表达量验证Caco-2中TRPV1基因的敲除效果,CCK-8检测TRPV1基因敲除细胞的生长曲线,与野生型细胞对比检测TRPV1基因敲除对细胞生长的影响.筛选出TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,而且TRPV1基因敲除对Caco-2细胞生长无显著影响.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了TRPV1基因敲除的CACO-2稳定细胞系,为后续研究辣椒素对肠道脂类吸收影响的机理研究提供了有利的工具.