proC及putP基因的敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了pro C和put P敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,pro C敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。put P敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,put P的敲除比pro C的敲除更有利于精氨酸的合成,put P的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。     

柠檬酸钠促进S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽联合高产

考察了柠檬酸钠对S-腺苷蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)联产发酵的影响,发现柠檬酸钠有利于SAM和GSH的联合高产。采用响应面分析法对柠檬酸钠浓度及其添加时间进行优化,模型预测和验证实验结果均表明在联产发酵6 h时一次性添加10 g/L柠檬酸钠的效果最佳。通过对SAM和GSH联产发酵过程进行分析,发现柠檬酸钠能够显著提高胞内NADH和ATP的水平,为SAM和GSH的过量合成提供了足够的能量物质,也为类似耗能化合物的生物合成及其发酵高产提供了可行的优化策略。     

工程改造龟裂链霉菌提高土霉素产量

土霉素是由龟裂链霉菌合成的一类广谱性抗生素,前期研究工作证明其生物合成受其自身途径特异性调控蛋白OtcR的直接调节,OtcR能够激活和促进土霉素合成基因簇的转录表达。在龟裂链霉菌M4018宿主内利用强启动子单独过表达OtcR蛋白,使土霉素的产量提高到原来产量的4倍;为了进一步提高土霉素产量,在M4108宿主内表达乙酰辅酶A羧化酶基因,提高其胞内土霉素合成的前体物丙二酸单酰辅酶A的含量。对出发菌株M4018进行工程改造,同时过表达途径特异性调控蛋白OtcR和乙酰辅酶A羧化酶,发酵检测改造后的重组工程菌株土霉素的产量由1.37g/L提高到9.09g/L,该研究策略对工程改造龟裂链霉菌提高土霉素的产量具有重要的指导意义。     

比较pta及ack敲除对钝齿棒杆菌产L-精氨酸生理代谢的影响

旁支代谢途径的截断有利于目的氨基酸合成途径的集流。基于基因组尺度代谢网络模型的预测,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过无痕敲除技术分别敲除了编码磷酸乙酰基转移酶的pta基因及编码乙酸激酶的ack基因,阻断了乙酸的合成。摇瓶发酵结果表明,pta缺失菌株精氨酸产量较出发菌株提高了25.60%,达15.46g/L。葡萄糖转化率提高了29.41%;ack缺失菌株精氨酸产量达13.82g/L,较出发菌株提高了12.81%,葡萄糖转化率提高了26.02%。同时,pta及ack敲除菌株的细胞生长较出发菌株均分别提高了9.19%及7.71%。因此,pta、ack的敲除不仅有利于精氨酸的合成,而且对菌体生长具有促进作用;但pta的敲除更有利于精氨酸的积累。     

D97N突变对光受体蛋白古紫质4质子泵和能量转换效率的影响

古紫质4(archaerhodopsin 4,aR4)是新近发现的古生菌Halobacterium species xz515红膜上唯一的光敏视黄醛蛋白,具有和细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)相似的质子泵功能,但在中性p H条件下,其质子释放和摄取顺序与bR相反。针对质子供体天冬氨酸97(Aspartic acid 97,D97)对aR4光循环;特别是对质子释放摄取顺序和菌株ATP生成率的影响,采用基因定点突变技术,构建了aR4的单突变体D97N,以及相对应的bR单突变体D96N。采用紫外-可见吸收光谱和闪光动力学光谱技术初步研究突变对视黄醛键合区、光反应中间态M态和O态、质子泵功能以及菌株ATP生成率的影响。结果表明,D97N突变对视黄醛紫外-可见光吸收波长没有太大影响,但造成M态衰减时间的显著延长、质子泵功能的消失及菌株ATP的生成率大幅降低。与bR中的D96作用相比,D97对aR4质子功能的影响有所不同,这可能与D97所处的一个更为疏水性的胞外侧环境有关。     

一种基于单交换原理的地衣芽孢杆菌基因敲除方法及应用

目的:基于同源单交换原理构建地衣芽孢杆菌基因快速敲除方法,提高基因敲除效率。方法:以地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)20085内切纤维素酶基因celb为拟敲除对象,利用重叠PCR技术将celb基因内约500bp片段与氯霉素抗性基因(Cmr)相连接,经末端单酶切后电转化至B.licheniformis 20085感受态细胞中,仅通过一次同源单交换,将抗性基因Cmr插入至celb基因内部,实现目的基因的敲除。结果:经过氯霉素抗性筛选和基因组PCR鉴定,成功获得celb基因缺失菌株B.licheniformis 20085Δcelb;发酵验证结果显示,B.licheniformis 20085Δcelb较原始菌株滤纸崩解能力显著降低,其中发酵60h后内切纤维素酶(CMC酶)活力由1.86U/ml降低至0.50U/ml,表明celb基因在地衣芽孢杆菌降解纤维素的过程中起着重要作用。结论:通过重叠PCR技术结合同源单交换原理能够实现地衣芽孢杆菌目的基因的快速敲除,为该菌株甚至其它微生物提供了一种基因功能快速鉴定的手段。     

黄原胶生物合成及分子调控

黄原胶(xanthan gum)是由黄单胞菌属(Xanthomonas)产生的一种胞外多糖,其凭借优越的流变性和稳定性被广泛应用于食品、石油、农业等行业。目前黄原胶的合成途径已经被阐明,其研究主要集中在如何通过分子调控影响其合成及改性以适应于不同行业需求。通过对黄原胶的一级和二级结构、流变性及稳定性、生物合成途径的介绍,综述了黄单胞菌属黄原胶的生物合成分子调控研究进展。主要结论如下:现有的分子调控研究集中于对黄原胶合成途径中各阶段关键基因、信号分子及其他因子的调控;在黄原胶前体合成阶段,可针对葡萄糖转化为磷酸糖、磷酸糖前体转化为二磷酸核苷糖、细胞内碳水化合物利用及转运等过程的相关基因对黄原胶的合成进行调控;在黄原胶的组装及分泌阶段,主要可通过调节gum基因簇的结构蛋白及启动子调控因子等调控;信号分子调控与环二鸟苷酸(c-di-GMP)信号网络系统及群体感应(quorum sensing, QS)系统中的信号分子水平等相关;其他因子包括脂多糖改性O-抗原相关基因,蛋白质/金属转运和分泌相关基因,肽聚糖和聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates, PHA)的底物竞争途径,以及血红蛋白基因等。未来应进一步挖掘新的黄原胶生物合成调控因子及完善分子调控机制。     

M145F/F146M突变对光受体蛋白细菌视紫红质和古紫质4光循环的影响

古紫质4(archaerhodopsin 4,aR4)与细菌视紫质(bacteriorhodopsin,bR)同属于盐杆菌科,同源性59%,均为光驱质子泵。其功能是在光照条件下将质子由胞内泵到胞外形成跨膜质子梯度,该梯度差被膜上另外一种蛋白ATP合成酶用于ATP的合成,从而完成光能向生物能的转化。aR4和bR具有相似的光循环过程,但质子传递时序不同,aR4是先从胞内吸收质子再将质子释放到胞外,而bR恰好相反。甲硫氨酸-145是位于bR视黄醛发色团键合区的一个重要残基,对其光循环有着重要的影响,而在aR4中处在相应位置上的苯丙氨酸-146是其视黄醛键合区与bR唯一不相同的残基。因此通过定点突变,采用紫外可见吸收光谱、动力学光谱、质子泵功能检测、低温透射红外光谱等手段对比分析研究M145F和F146M单点突变对bR和aR4光循环造成的影响,有助于深入理解aR4结构与功能的关系。研究结果表明,M145F突变造成了bR光循环L的丢失和质子泵功能的减弱,而F146M突变并未对aR4的光循环造成显著影响,且突变后aR4质子释放时序没有反转,表明该位置上的残基在两个体系中的作用不尽相同。     

酿酒酵母的甘油和乙醇生物合成对异丁醇产率的影响

通过过表达酿酒酵母异丁醇合成途径中的相关基因,以及缺失编码合成甘油和乙醇的关键基因,来提高异丁醇产率。过表达酿酒酵母异丁醇合成途径中,乙酰乳酸合酶(Ilv2)和支链氨基酸转氨酶(Bat2)并缺失编码甘油合成的关键基因GPD2得到菌株HZAL-13(YEplac181-PGK1p-ILV2ORF),其厌氧发酵异丁醇产率比出发菌株增加3.91倍;在HZAL-13的基础上进一步缺失乙醇合成途径中编码丙酮酸脱羧酶的关键基因PDC6,得到菌株HZAL-14(YEplac181-PGK1p-ILV2ORF),其厌氧发酵异丁醇产率较出发菌株增加8.97倍。研究结果表明减少副产物甘油和乙醇的生物合成有助于提高异丁醇的产率,利用基因工程方法缺失GPD2基因为提高异丁醇产率提供了新方向。     

重组sTNFα-R1蛋白同义密码突变库的构建及筛选

目的:以重组肿瘤坏死因子-α受体1(sTNFα-R1)的基因序列为模板,构建同义密码突变库,在不改变原氨基酸序列的同时筛选获得目标蛋白产量提高的突变菌株。方法:分段设计并合成同义密码突变兼并引物,通过优化PCR反应条件,构建目的基因的完整同义密码突变库。突变库经双酶切插入到pET11(b)载体上,并电转至E.coli BL21(DE3)细胞中。阳性克隆经PCR鉴定后,细胞表达目标蛋白,应用SDS-PAGE等方法分析目标蛋白产量。结果:目的基因同义突变库的PCR扩增产物可见330bp的特征条带,突变库测序结果显示整个基因序列的第三位碱基发生预期的同义突变;完成了445株克隆筛选,针对其中产量高于对照组的45株克隆进行测序,获得42株基因序列不同但氨基酸序列未发生变化的克隆菌株,其同义密码突变阳性率高达93%;选择其中2株初筛产量较高的菌株进行放大验证,结果显示7#突变株的包涵体收率及目标蛋白相对百分含量明显高于对照株,其每升发酵液的目标蛋白总产量比对照株提高2.44倍,405#突变株比对照株提高1.44倍。结论:通过优化PCR反应条件成功构建了目标基因全序列的同义密码突变库,采用同义密码突变库技术途径,在不改变原氨基酸序列的前提下可以快速优化蛋白表达产量。