液氮深冷保存组织培养细胞

组织培养细胞可长期冻存于液氮中,而不改变其性状。本文报导了组织培养细胞进行液氮冻存时,不同保护剂和冷冻程序对细胞的保护作用。结果表明,在冷冻过程中用二甲基亚砜作保护剂对细胞的保护作用比甘油更好,冻存后细胞存活率可达90％以上:实验比较了二种不同冷冻程序时细胞存活率,认为4℃-液氮气态-液氮的冷冻程序对细胞损伤较小。根据实验结果,我们冻存了二株人二倍体细胞和几系传代细胞,这些冻存的细胞,复甦时细胞存活率在61.9～93.2％,复甦的细胞96.8％可复活生长成单层培养。     

低温保存对Hep-G2细胞凋亡的影响

样本质量是体现生物样本库价值的关键,但是低温保存可能导致细胞凋亡及基因表达量的变化,影响样本质量。本文采用流式细胞术与实时荧光定量PCR(qPCR)的方法,研究了Hep-G2细胞在不同条件下冻存后凋亡及相关基因表达量。结果表明:低温保存影响Hep-G2细胞的成活率、凋亡情况及某些凋亡基因表达量。无论冻存过程中是否添加低温保护剂,低温保存都会对细胞的凋亡相关基因表达带来不同程度的影响。不添加保护剂冻存会导致细胞死亡,添加10%DMSO冻存会导致细胞凋亡,复苏培养24 h后细胞的成活率、凋亡情况与相关基因表达量基本与对照组水平一致。     

细胞冻融策略优化及设备研究进展

低温冷冻保存是细胞治疗、辅助生殖等生物医学应用的使能技术之一.冷冻和复苏过程中,胞内外冰晶的形成和生长会对细胞产生损伤;其中,升降温速率又与冰晶的形成、生长有密切关系.本文在阐述程序化慢速冷冻和玻璃化快速冷冻两种细胞冻存方式及冷冻损伤两因素假说的基础上,对细胞特性、细胞外环境和升降温策略三个影响细胞冻存效果的要素进行分...     

PDMS-玻璃微流控芯片上附着态HepG2细胞低温保存条件研究

微流控芯片上细胞样本的低温保存能够显著缩短芯片上细胞实验周期、降低实验成本,有助于芯片上细胞实验的广泛应用。本文对PDMS-玻璃微流控芯片上附着态HepG2细胞的低温保存条件进行了研究,包括降温速率、低温保护剂、低温存储时间及存储温度,确定了芯片上附着态HepG2细胞的低温保存方案。结果表明：采用不同的冷却环境、冷却介质,芯片微通道内能够实现0.36~35.12 ℃/min的降温速率;芯片上附着态HepG2细胞低温保存存在最优降温速率0.5~1.5 ℃/min;﹣20 ℃或液氮表面上方40 cm处冷却环境与﹣80 ℃冷却环境组合冻存能够显著提高芯片上冻存7 d的HepG2细胞存活率;体积浓度为20%的DMSO与0.1 mol/L海藻糖联合能够显著提高芯片上冻存HepG2细胞活性。经过上述冻存条件优化后,芯片上附着态HepG2细胞冻存7 d活性超过90%。     

胎儿垂体超低温保存技术的研究

本研究将11例4～6个月龄的胎儿垂体以机械法制备了细胞悬液。6例观察了不同保护剂条件下的液氮(—196℃)冻存效果。5例观察了冻存前、后离体培养的结果。经计算机图象分析仪处理,测定细胞直径,放免法检测培养液上清中的GH含量及Wilsoin垂体细胞特异染色法鉴定。结果表明:垂体细胞经低温冻存后仍有较高的活性,一定量的DMSO与血清混合使用对垂体细胞的冻存效果最好。冻存及离体培养的垂体细胞均可做为移植用供体来源。     

人肝癌细胞Hep-G2的低温保存研究

在细胞的低温保存中,低温保护剂的种类与浓度对复温后的存活率有着重要影响。本文以人肝癌细胞Hep-G2为研究对象,利用慢速冷冻法,筛选最佳的冻存液配方。通过配比不同浓度的甘油、Me2SO以及在Me2SO中添加一定浓度的蔗糖、海藻糖,一周后复温细胞,对台盼蓝染色存活率、MTT存活率以及24 h贴壁率三种检测结果进行比较分析,结果表明:以Me2SO作为低温保护剂时,冻存液浓度为10%(v/v)的Me2SO复温后细胞的三种检测指标最优;以甘油作为低温保护剂时,冻存液浓度为20%(v/v)的甘油复温后细胞的三种检测指标最优;再将以上分别得到的最佳浓度(即体积浓度20%甘油、10%Me2SO)与5%Me2SO(v/v)+0.3 mol/L蔗糖、5%Me2SO(v/v)+0.3 mol/L海藻糖这四种低温保护剂进行冻存与比较,5%Me2SO(v/v)+0.3mol/L海藻糖检测指标高于其他实验组,并且差异显著(P0.05)。最终得到5%Me2SO(v/v)+0.3 mol/L海藻糖为慢速冷冻保存Hep-G2细胞的最优保护剂配方。     

糖醇类物质对人肝细胞低温保存的影响

将传统肝细胞冻存保护剂配方中的DMSO的浓度减为5%,并添加不同浓度的D-山梨醇、木糖醇或麦芽糖醇,置于-80℃的冰箱冻存两周,两周后将细胞快速复温,进行细胞存活率、24h贴壁率以及细胞形态学的检测,并与10%浓度DMSO组对照比较。结果表明,D-山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇均对人肝细胞的低温保存有一定的保护作用,其中5%DMSO+0.4M D-山梨醇组复温后细胞的存活率、贴壁率均优于其他冻存液组,D-山梨醇与DMSO联合使用降低了冻存保护剂DMSO的浓度,表明两者有协同作用。     

骨髓,胎肝和外周血造血干细胞的低温生物效应

用生物降温仪、低温显微镜和细胞化学、细胞培养等技术研究证明,低温保存液的相变温度随降温速率的加快而增高,以1℃/min降温时,其相交点在—13.9℃,骨髓细胞浓度对相变温度无影响。液氮(—196℃)冻存后,外用血淋巴细胞体积无明显变化,其糖原和非特异性酯酶含量明显降低。胎肝细胞冻存1098天染色体正常,冻存930天后氧耗量与新鲜值无明显差别,冻存7天后超微弱发光强度为新鲜值的92％。小鼠骨髓和皮肤冻存后,移植免疫排斥反应降低。人骨髓冻存3～300天,胎肝冻存1～1257天,外周血冻存6～53天,其CFU—GM回收率分别为68.9％、62.0％和77.3％。造血细胞活力不随保存时间延长而降低。     

肝细胞复合体在慢速冻存过程中热膨胀损伤机理研究

在单层贴壁细胞的慢速冻存中,细胞从基质上脱落是影响冻存效果的的主要因素之一。造成这种脱落的主要原因是基质和细胞的热膨胀系数差异,而降温速率和终温均为影响热膨胀系数变化的因素。本文通过测量肝细胞及微载体在慢速冷冻过程中（降温速率分别为1、2和5 ℃/min,终温为﹣30 ℃）热膨胀系数,对比筛选出热膨胀差异最小时的冻存方案,研究热膨胀损伤对肝细胞复合体冻存效果的影响。实验结果显示：降温速率为1 ℃/min时,肝细胞与微载体间的热膨胀差异最小,对应的复合体冻存效果最好,其存活率和贴壁率分别为62.66%±0.67%和37.2%±1.25%。细胞与微载体间的热膨胀损伤存在于整个降温过程,是影响肝细胞复合体冻存效果的主要因素之一。     

海藻糖和胎牛血清对人乳腺细胞HBL-100低温保存的影响

建立高质量的生物样本库至关重要,低温保存过程中保护剂的种类和浓度对样本的冷冻效果有很大影响。本文以人乳腺细胞HBL-100为研究对象,在Me_2SO含量10%的DMEM溶液中分别添加不同浓度海藻糖(0~0.3 mol/L)和不同体积分数FBS(20%~60%)。采用逐步降温法,先在-80℃冰箱中慢速降温4 h,再快速投入到液氮中(-196℃),冻存7 d后,在37℃水浴锅中快速摇晃复温。分别用台盼蓝法、CCK法和24 h贴壁率法检测细胞的成活率,结果表明:与对照组相比,海藻糖和FBS对细胞的冷冻效果都有显著影响。当海藻糖浓度一定时,FBS体积分数越高,细胞的冷冻效果越好,但不添加海藻糖时,FBS的作用不明显;当FBS体积分数一定时,三种检测指标在海藻糖浓度为0.2 mol/L时最优,且高浓度海藻糖可能会抑制FBS作用。考虑成本等因素,最适宜冻存人乳腺细胞HBL-100的冻存液为10%Me_2SO+40%~60%FBS+0.2 mol/L海藻糖。     

微波复温对玻璃化冻存小鼠骨髓有核细胞活性的影响

对ICR小鼠骨髓有核细胞进行玻璃化深低温保存,在冻存1、5、10、20、30d后,骨髓有核细胞样品分别采用常规的38℃水浴复温和微波复温,即在300mL10℃水中,控制微波功率为800W,频率2450MHz,复温时间80s.检测骨髓有核细胞的功能变化,比较两种复温方法对细胞活性的影响.结果表明:骨髓有核细胞玻璃化冻存1～20d,其存活率、细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性都有下降的趋势,过氧化氢(H2O2)含量显著增加,但冻存20d后这些指标保持基本稳定,与第30d比较无显著差异(P＞0.05).微波复温组的细胞存活率,细胞内SDH、SOD的活性高于水浴复温组,细胞内H2O2含量明显低于水浴复温组.说明微波复温能够提高复温速率,对骨髓有核细胞的损伤要低于水浴复温.     

快速冻存对人骨髓细胞功能的影响

本文采用快速冻存技术深低温保存人骨髓有核细胞(BNC)和人骨髓单个核细胞(BMNC)。在冻存后1、10、20和30天,38℃水浴快速复温,离心洗脱低温保护剂,检测骨髓细胞活力变化。快速冻存30天,骨髓细胞的回收率为80.6％,存活率为85.2％,DNA合成能力和细胞膜完整性仍可维持在较高水平,与常规慢速冻存组的结果比较无显著差异(P>0.05)。提示快速冻存仍能保持人骨髓细胞的一定活力。     

人胎肝细胞的低温保存和临床应用

102例人胎肝细胞在液氮中(—196℃)保存1—1257天后,平均细胞回收率、CFU—GM回收率和台盼兰拒染率分别为98％、71％和62％。18例再生障碍性贫血患者输注了冻存胎肝细胞,9例显示了较好的治疗效果;2例白血病患者冻存胎肝移植成功;冻存胎肝细胞输注对改善肝脏疾病的临床症状有一定好处。     

胡萝卜抗冻蛋白的新型生物抗冻剂的研制

研究了基因工程方法制备的胡萝卜抗冻蛋白在大肠杆菌和水稻悬浮细胞团的低温和超低温冻存实验中提高细胞抗冻的性能．结果表明，在大肠杆菌的冻存实验中，三个处理温度中胡萝卜抗冻蛋白都明显提高了细胞的存活率，与阳性对照基本一致；而在水稻悬浮单细胞的冻存实验中，胡萝卜抗冻蛋白比阳性对照展示了更好的保护细胞的能力，其恢复后的细胞活力和相对细胞活力高，细胞死亡率低，而且在后续复苏培养过程中都能进行有效的子代细胞分裂．实验结果表明，通过基因工程方法大量生产的胡萝卜抗冻蛋白可有效适用于真核细胞的低温保存和超低温保存．     

基于蚕丝蛋白的低温保护剂用于梅山猪耳成纤维细胞的低温保存研究

细胞低温保存为临床治疗和科学研究提供优质的细胞。体积分数为10%二甲基亚砜(DMSO)和体积分数为20%胎牛血清(FBS)是目前冻存细胞常用的保护剂。但DMSO对细胞具有毒性损伤,FBS存在携带病毒、感染疾病的风险。本文以梅山猪耳成纤维细胞作为模型细胞进行冻存实验,将蚕丝蛋白用于低温保护剂中,用不同质量浓度的丝胶蛋白和不同体积分数的丝素蛋白来分别替代FBS和DMSO,验证其在细胞低温保存中的有效性。解冻复苏后用台盼蓝染色法、MTT法、24 h贴壁率等检测细胞的存活率和生长活力,筛选出最佳的基于天然蚕丝蛋白的低温保护剂配方。结果表明:含质量浓度为1%丝胶蛋白和含体积分数为20%FBS的低温保护剂对猪耳细胞的冻存效果无显著差异,说明丝胶蛋白能有效替代FBS。将体积分数为10%DMSO浓度降至5%,添加体积分数为10%丝素蛋白后,细胞的存活率和贴壁率与对照组相比无明显差异,说明丝素蛋白能降低DMSO的浓度。将质量浓度为1%丝胶蛋白与体积分数为10%丝素蛋白联用后,能达到较好的冻存效果。     

超低温对人淋巴细胞和红细胞某些表面标志的影响

有效的血细胞保存,在理论研究和实际应用上都有十分重要的意义。本研究的目的是用我们自己建立的方法冻存人外周血淋巴细胞和红细胞,观察超低温对这些细胞某些表面标志的影响。一、材料和方法1.细胞悬液:外周肝素抗凝血,用淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)2000rpm离心20分钟分离,Hanks液洗后,用20％小牛血清1640(日水制药株式会社)液制成细胞悬液。2.冻存方法:向细胞悬液中缓慢加入二甲亚砜(DMSO上海金山化工厂)直至10％或     

可视化DSC新设备及其在低温冻存研究领域的应用

研制了一套具有可视化功能的差示扫描量热法实验装置(简称可视化DSC),它能在热分析的同时,通过配套使用的显微摄像系统实时观察并记录测试样品的微观结构变化,以同时获得测试样品的热效应数据和微观结构图像数据.利用可视化DSC对低温保护剂1,2-丙二醇和聚乙烯醇(PVA)溶液进行冻结实验,考察PVA对低温保护剂溶液冻结特性的影响,结果表明,在1,2-丙二醇溶液中添加PVA能有效抑制冰晶成核和生长;选择PVA作为冻存液添加剂,利用可视化DSC对脐带血间充质干细胞(MSCs)进行程序冷冻-解冻实验,考察PVA在MSCs低温冻存中的实际效果,结果表明,在冻存液中添加PVA,有助于抑制冰晶形成,降低细胞冷冻损伤,提高细胞在程序慢速冷冻-解冻后的存活率.     

中日低温医学研讨会

由中国制冷学会邱忠岳副秘书长任团长,上海新华医院刘运章主任和北京解放军总医院刘作斌主任为副团长的35人代表团,于1991年11月19—23日在日本福岗参加了第4届中日低温医学研讨会。参加会议的还有美国、德国、加拿大和阿根廷的专家,共100余人。会上共发表论文78篇。与会学者认真地讨论了低温生物学、低温保存、低温免疫和冷冻外科领域的现状和发展趋向。主要内容概述如下。红细胞冻存(-196℃)27年的回收率为67.8％.仅福岗红十字血液中心1983年以来已输注冻存自体血3638人次。冻存自体血回输可防止输血性肝炎等并发症。冻存血小板的回收率已提高到80％。冻存的     

洗脱二甲基亚砜对冻存胎肝造血细胞活力的影响

人胚胎肝细胞在-196℃低温保存后,其重建大剂量化疗或放疗患者的造血功能主要取决于造血祖细胞(GM—CFU—C)的含量。为了有效的保存造血细胞活力,目前常用的方法是在冷冻保存液中添加冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)。在用体外琼脂培养的方法测定冻存骨髓样品中 GM—CFU—C 产率时,我们曾发现 DMSO 对集落生长有一定的抑制作用,因此在体外培养时需要洗脱 DMSO。为了判定低温保存效果,并为临床应用提供较准确的 GM—CFU—C 数量,我们研究了人胎肝细胞冻存后洗脱 DMSO 对 GM—CFU—C 产率的影响。     

蓄能融霜脱冻系统的研究

本系统借助贮液器存液降压瞬间产生大量饱和汽体进行融霜脱冻，其脱冻时间仅为压缩机排气脱冻的１／２５～１／５０，简化了操作、加快周转、节约能源。