人源核糖体展示单链抗体库的构建

目的构建人源核糖体展示单链抗体(scFV)库。方法从人外周血单个核细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计多对具有简并性特点的引物,PCR扩增人免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在其两端加上核糖体展示所需元件,并通过重叠PCR法将VH和VL经(Gly4Ser)3短肽连接成单链抗体,构建核糖体展示库。结果利用不同引物进行PCR时,绝大多数引物能扩增出300～400 bp的VH和VL片段;通过大引物扩增成功加上了核糖体展示所需元件,重叠PCR体外连接成约900 bp大小的scFv基因,大量扩增得到核糖体展示库。结论已成功构建了人源核糖体展示scFv库,为人源抗体药物的开发奠定了基础。     

从半合成噬菌体抗体库筛选抗狂犬病毒人单链抗体

目的　应用纯化的狂犬病毒抗原从半合成噬菌体抗体库中筛选针对狂犬病毒的人单链抗体(ScFv)。方法　用固相化的狂犬病毒抗原对半合成抗体库进行 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,从第 3轮洗脱下来的克隆中获得一株有可溶性表达且特异性结合狂犬病毒抗原的ScFv ,并进行基因序列测定。结果　所获氨基酸序列经blast数据库搜索 ,与一种抗狂犬病毒免疫球蛋白的氨基酸序列同源性最高 ( 82 % )。经检索kabat数据库 ,发现其轻、重链可变区分别属于VkⅠ型、VHⅢ型。结论　从噬菌体抗体库可以方便快捷地分离到针对狂犬病毒的单链抗体 ,对狂犬病毒的预防具有重要意义     

人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选

目的构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选。方法以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定。以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性。结果获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性。结论已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法。     

从大容量噬菌体抗体库获取人源性抗角蛋白抗体ScFv及Diabody的构建

目的从大容量噬菌体抗体库筛选人源性抗角蛋白抗体,并构建双体抗体(Diabody)。方法以固相化的角蛋白对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,经3～4轮筛选后,挑取克隆,ELISA法鉴定其特异性,并对部分抗角蛋白阳性抗体克隆基因进行DNA序列分析。选取活性好的克隆基因进行改造,构建Diabody表达载体。结果在抗体库的筛选过程中可见明显的富集现象,获得了29株可与角蛋白特异性结合的人源单链抗体,选取4个克隆基因进行序列分析,结果表明,4个克隆的轻链基因均属于λ轻链第1亚群,1号和8号克隆的重链基因属于人IgG第2亚群,6号和29号克隆分别属于第1和第3亚群。从表达抗角蛋白抗体的集落中挑选一个进行基因改造,构建的Diabody表达载体所表达的Diabody活性较高。结论利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗角蛋白抗体,并改造成应用前景较好的Diabody,为开发银屑病治疗性抗体奠定了基础。     

全人源单链抗体库噬菌体展示技术的建立

目的建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术。方法采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(V_H)和轻链可变区片段(V_L),然后以V_H和V_L为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfiⅠ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM13过夜培养,上清液经PEG-NaCl沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定。结果成功构建了库容为2. 6×10~9的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体。结论成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选。     

基于噬菌体抗体库技术制备诺如病毒全人源单链抗体

目的 基于噬菌体抗体库技术制备抗诺如病毒(norovirus,NoV)全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)。方法 从GⅡ. 6 NoV感染者恢复期外周血中分离得到外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),提取总RNA,RT-PCR法分别扩增scFv的重链和轻链可变区基因片段,通过Overlap PCR技术将两者随机拼接成scFv基因片段。将scFv基因克隆至噬菌体质粒pCANTAB-5E,转化至感受态E. coli TG1,获得全人源scFv噬菌体抗体库。以GⅡ. 6 P蛋白为固相抗原对抗体库进行4轮生物筛选,以选取的特异性抗NoV阳性噬菌体为模板,扩增scFv基因后,进行原核表达及纯化,并鉴定其特异性及中和性。结果 人源噬菌体scFv抗体库库容约为8.8×10⁶PFU/mL。4轮生物筛选共获得10株scFv,均能与GⅡ. 4、GⅡ. 6和GⅡ. 17 NoV P蛋白发生特异性结合,且对3株NoV毒株均有不同程度的阻断作用。结论 利用GⅡ. 6 NoV感染...     

构建大容量噬菌体抗体库及获得人源抗体的策略

构建大容量噬菌体抗体库,可实现不经免疫直接制备针对任意抗原的人源性抗体。本文综述了噬菌体抗体库技术的原理、抗体库的构建方法、不经免疫制备人源抗体的策略以及提高抗体体外亲和力的方法。     

大容量人源天然噬菌体抗体库的构建

目的构建大容量(>108)的人源天然噬菌体抗体库。方法提取人外周血淋巴细胞mRNA,反转录出cDNA第一链,以此为模板,PCR扩增重链(VH)和轻链(VL)基因片段。将VL基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建轻链库,再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建初级库。进一步用初级库超感染BS1365菌,使其VH与VL发生重组,获得重组库,再利用重组库感染大肠杆菌XL1-Blue,构建工作库。结果所有VH和VL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符,轻重链基因的克隆效率均为100%。初级库容量为108,滴度为6×1013;重组后的工作库有效容量为8×1010,滴度至少为1×1013。结论已构建容量为1010的人源天然噬菌体抗体库。     

核糖体展示技术筛选抗呋喃唑酮单链抗体

目的 运用核糖体展示技术筛选高特异性抗呋喃唑酮(furazolidone,FZD)单链抗体,并进行初步分析。方法 提取小鼠杂交瘤细胞总RNA,利用反转录PCR及重叠延伸(splicing by overlap extension,SOE)-PCR技术合成V_H-linker-V_L单链抗体文库。采用TNT T7 Quick for PCR DNA试剂盒对单链抗体文库进行体外翻译及筛选,经过三轮筛选富集目的基因,对目的基因进行原核表达及纯化后,初步分析其特异性及亲和力。结果 获取1株特异性较高的单链抗体FZD-ScFv1,IC₅₀值为13.01 ng/mL,与呋喃它酮、呋喃妥因、氨基脲、呋喃西林及其衍生物之间的交叉反应率均小于1%。结论 利用核糖体展示技术成功获得亲和力较好的单链抗体,该抗体可用于建立ELISA法,为FZD残留量的快速检测提供了新的思路。     

鼻咽癌人源抗独特型单链抗体诱导的免疫应答

目的观察鼻咽癌人源抗独特型单链抗体G22ScFv在小鼠体内诱导的免疫应答,探讨其作为鼻咽癌疫苗的可能性。方法在大肠杆菌中诱导表达G22ScFv并进行纯化,以纯化的G22ScFv免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA及竞争抑制ELISA检测免疫小鼠特异性体液免疫应答水平;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表型的变化。结果纯化的融合蛋白纯度达95%以上,且具有良好的反应原性。经ELISA检测,G22ScFv免疫后,小鼠产生了Ab3,且小鼠脾脏CD4+、CD8+T淋巴细胞数量升高。结论G22ScFv可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫应答,为鼻咽癌人源抗独特型抗体疫苗的临床应用奠定了基础。     

免疫抗体文库的构建及亚nM高亲和力人源抗体的筛选

目的构建免疫抗体文库,并筛选亚nM高亲和力人源抗体。方法采用破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)免疫的高效价人B淋巴细胞,经PCR扩增可变区基因,构建免疫抗体文库,并筛选高亲和力人源抗体。将获得的抗体基因片段转换成全分子,进行真核表达和纯化,并与人抗TT多克隆抗体进行比较分析。结果构建的人破伤风免疫噬菌体抗体库库容为4.5×106,多样性符合引物设计要求,经筛选获得相对亲和力为10-10M的高亲和力人源抗体,其体内中和活性高于人多克隆抗体。结论根据抗体基因使用频率设计引物构建小容量免疫抗体文库,可获得亚nM的高亲和力人源抗体,该策略可用于抗感染性疾病人源抗体的开发。     

抗转铁蛋白受体鼠源性单链抗体基因的构建、表达及初步鉴定

目的　利用基因工程技术将鼠源性单克隆抗体WuT9改造成单链抗体。方法　从分泌抗CD71单克隆抗体的杂交瘤细胞WuT9中提取总RNA ,采用OligodT为逆转录引物 ,逆转录合成cDNA第一链 ,然后分别采用VL 和VH 框架区的PCR引物 ,扩增VH(重链可变区 )和VL(轻链可变区 )DNA片段 ,利用事先合成的存在于VL 下游引物和VH 上游引物的部分人工连接子重叠互补序列 ,将VL 和VH 的PCR回收产物进行部分重叠PCR(SOE) ,形成单链抗体基因。最后将此基因重组进表达载体pBAD gIII C中 ,经L arabinose(左旋阿拉伯糖 )诱导表达并初步鉴定。结果　构建出 70 0bp左右的单链基因 ,并获得阳性重组表达载体克隆 ,表达产物为相对分子质量 2 70 0 0左右的蛋白分子。结论　经因特网查询表明 ,单链抗体基因重链部分属于小鼠H链可变区ⅠA亚组 ;轻链属于小鼠κ轻链可变区Ⅱ亚组 ,此单链抗体基因的表达产物具有一定的特异结合活性。本研究为抗CD71单链抗体的临床应用打下了基础。     

采用基因拼接方法构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库

目的　构建人源特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌体抗体库。方法　从抗乙型肝炎病毒表面抗体高滴度 (1:10 2 4 )的人全血中分离外周血单个核细胞 (PBMC) ,经RT PCR分别扩增出轻链可变区和重链可变区 ,再以噬菌体质粒为模板分别扩增出轻链恒定区 (Cκ)和重链恒定区 (CH1) ,将轻链可变区和轻链恒定区 (Cκ)及重链可变区和重链恒定区 (CH1)进行第 1次基因拼接 ,分别形成κ轻链和Fd重链 ,再以κ轻链和Fd重链作为模板进行第 2次基因拼接 ,形成完整的Fab基因 ,与pComb3H SS噬菌体质粒连接后 ,电穿孔转化大肠杆菌XL1 Blue。结果　通过多次电穿孔转化 ,获得总容量为 4× 10 5库容的噬菌体抗体库。结论　构建的Fab抗体库可用于筛选特异性抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab抗体分子     

抗氨基末端脂多糖结合蛋白基因工程抗体库的构建及体外表达筛选

目的构建人源化的单链可变区抗体库,运用体外表达技术翻译并筛选特异性的抗NHLBP抗体。方法分离健康人外周血单核细胞,抽提总RNA设计引物,扩增抗体轻重链的可变区,通过一段柔性片段将其连接成单链抗体库;应用体外表达技术翻译抗体库,并筛选出与NHLBP高度结合的单链抗体片段。结果扩增的单链抗体可变区片段分别为340bp和325bp,经连接后约为750bp。经过体外表达得到了约27000的抗体片段,经过5轮筛选进化,得到了可与NHLBP高度结合的抗体。结论已成功构建了人源化的单链抗体库;通过体外表达技术筛选到可与NHLBP高度结合的抗体。     

Application of the Mutant Libraries for Candida albicans Functional Genomics

Candida albicans is a typical opportunistic pathogen in humans that causes serious health risks in clinical fungal infections. The construction of mutant libraries has made remarkable developments in the study of C. albicans molecular and cellular biology with the ongoing advancements of gene editing, which include the application of CRISPR-Cas9 and novel high-efficient transposon. Large-scale genetic screens and genome-wide functional analysis accelerated the investigation of new genetic regulatory mechanisms associated with the pathogenicity and resistance to environmental stress in C. albicans. More importantly, sensitivity screening based on C. albicans mutant libraries is critical for the target identification of novel antifungal compounds, which leads to the discovery of Sec7p, Tfp1p, Gwt1p, Gln4p, and Erg11p. This review summarizes the main types of C. albicans mutant libraries and interprets their applications in morphogenesis, biofilm formation, fungus–host interactions, antifungal drug resistance, and target identification.     

Evaluation of Anti-Candida albicans Activity and Release of Ketoconazole in PMMA-G-PEG 4000 Films

Modified release systems depend on the selection of an appropriate agent capable of controlling the release of the drug, sustaining the therapeutic action over time, and/or releasing the drug at the level of a particular tissue or target organ. Polyethylene glycol 4000 (PEG 4000) is commonly employed in drug release formulations while polymethyl methacrylate (PMMA) is non-toxic and has a good solubility in organic solvents. This study aimed at the incorporation of ketoconazole in PMMA-g-PEG 4000 and its derivatives, thus evaluating its release profile and anti-Candida albicans and cytotoxic activities. Ketoconazole was characterized and incorporated into the copolymers. The ketoconazole incorporated in the copolymer and its derivatives showed an immediate release profile. All copolymers with ketoconazole showed activity against Candida albicans and were non-toxic to human cells in the entire concentration tested.