转几丁质酶基因烟草遗传稳定性研究

从转几丁质酶基因烟草株系(NPTII基因是选择标记基因)对卡那霉素的抗性,及外源几丁质酶基因表达蛋白的活性(Western Blot检测)两个方面对转基因株系的遗传稳定性进行了分析研究。在卡那霉素抗性检测试验中,检测了13个T₂转基因株系,其中9个株系被检测种子100%对卡那霉素(100 mg/L)具有抗性;T₃和T₄转基因株系各检测了10个,100%被检测种子在含卡那霉素100 mg/L的MS培养基上长成了烟苗。Western Blot检测了11个T₂株系,检测结果表明,6个株系被检测植株100%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株80%含有外源几丁质酶蛋白,2个株系被检测植株50%含有外源几丁质酶蛋白,1个株系被检测植株19.05%含有外源几丁质酶蛋白。在温室内将转基因烟草与未转基因烟草密植在一起,种植2代,烟株开花期模仿自然风力对烟株吹风,进行了转基因烟草是否可以通过花粉进行基因漂移的研究。研究结果表明,在自然风媒条件下未发现转基因烟草可进行基因漂移。      

几丁质酶基因在烟草栽培品种中的表达

利用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）对来源于一种生物杀虫剂（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）的几丁质酶基因进行体外扩增，并插入载体质粒ｐＲＯＫ２中，然后转化大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ１Ｂｌｕｅ。用重组质粒ｐＲＯＫ２ＤＮＡ转化植物转基因载体——土壤农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株。借助于土壤农杆菌侵染烟草叶圆片，将目的基因导入。通过组织培养诱导生芽和生根，获得烟草再生植株。利用含卡那霉素的培养基对再生烟株进行初步筛选。进一步ＰＣＲ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹检测结果表明：转基因烟草中有几丁质酶基因和蛋白的表达。初步检测结果表明：转基因烟草具有较高的几丁质酶活性。     

细菌几丁质酶基因转化烟草的研究

为了提高烤烟品种K 32 6对真菌病害的抗性 ,以烟草再生植株的叶片为受体 ,采用农杆菌介导法将细菌几丁质酶基因导入烟草 ,获得了抗卡那霉素的转化植株 ,经PCR检测 ,初步证明了细菌几丁质酶基因已整合到烟草的基因组中 ;同时研究了再生烟草叶片的耐卡那霉素水平、受体预培养对转化的影响以及促进转化植株的生根等。结果表明 :培养基中卡那霉素浓度为 5 0mg/L时 ,能完全抑制烟草叶片的再生 ;烟草叶片预培养 2d的转化率提高 ;添加 0 .2mg/LIAA(吲哚乙酸 )能显著地提高转化植株芽梢的生根率。     

转几丁质酶-葡聚糖酶双价基因水稻稻米毒理试验

通过小鼠急性毒性试验、小鼠致突变试验、大鼠90d毒性试验,对转几丁质酶-葡聚糖酶双价基因水稻稻米的毒理进行了初步的评价。转基因大米粉MTD≥37.5g/kg灌胃给予小鼠,连续观察7d,动物全部存活,表现正常,未见中毒反应。致突变灌胃给予小鼠,未发现对小鼠骨髓细胞微核和精子畸形发生率有不良影响。转基因大米粉分别以15、7.5g/kg/d,90d灌胃大鼠,其行为活动、外观体征、饮食、粪便、体重,结果均无异常,5项血液学检查和13项生化指标检测及尸体解剖观察、脏器系数、脏器病理学检查,结果均属正常,与空白对照无显著差异。转基因大米粉结果提示携带几丁质酶基因、葡聚糖酶基因、NPT-II标记基因等外源DNA的转基因大米无明显的毒性和致畸作用。     

转复制酶基因抗病毒烟草的研究

将携带烟草花叶病毒(TMV)54KD蛋白基因和黄瓜花叶病毒(CMV)3'端缺失0.9kb的复制酶基因片段的植物表达载体pBICT,通过很痛农杆菌311SE系,利用叶圆盘法转化烟草,在含有卡那霉素的选择培养基上诱导生芽、生根,得再生植株53株。移入大田后,选取5株,提取植物总DNA,Southern杂交检测,结果5株中均有复制酶基因的整合,且转基因植株在大田中表现了良好的抗TMV和CMV能力。      

烟草转基因检测标准及PCR反应体系的研究

通过对PCR体系和反应条件的优化,确定了针对35s启动子序列进行转基因检测的最佳反应体系和反应条件,利用纯阳性模板经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳确认1ng模板DNA为纯阳性样品理想扩增下限,同时以不同阳性含量的干烟叶为材料,确定了烟叶转基因检测的标准为0.1%,建立了转基因外标定量法,并通过已知阳性含量样品的检测对该反应体系和检测标准进行了结果验证      

应用多重PCR技术筛选检测转Bt基因作物

Bt基因在抗虫转基因作物中广泛应用,是转基因食品筛选检测中最主要的目的基因。本研究依据核苷酸序列分析结果,将在转基因作物中常见的8种Bt基因(cry1Ab、cry1Ac、cry1Ab/Ac、cry1A.105、cry1Ac-M、cry2Ab、cry3A和cry3Bb)划分为cry1A、cry2A、cry3A三个组,并根据每个组的一致性序列设计了可分别检测各组Bt基因的特异性检测引物,其中cry1A组采用了简并引物,经过特异性、灵敏度等测试,建立了针对cry1A组、cry2A组和cry3A组的单一PCR检测方法。此外,通过将这三对检测引物放入同一PCR体系中,还建立了可特异检测上述3组Bt基因的三重PCR方法。结果表明,本研究建立的单一PCR和三重PCR方法均可从各类样品中准确检测出预期Bt基因成分,检测灵敏度达到0.1%。本方法特异性强、灵敏度高,在转基因成分的筛选检测中有很好的应用前景。     

利用PCR方法检测转BT基因水稻

应用PCR技术进行转基因水稻检测研究。本文以转基因水稻为材料,以聚合酶链式反应（PCR）方法为基础,选择适用于转基因食品安全性检验的核酸检测技术,针对转基因水稻中普遍存在的花椰菜花叶病毒（CaMV35S）启动子、胭脂碱合成酶（NOS）终止子、和转入苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,简写为Bt）基因水稻的CrylAc片段进行PCR检测,建立适合转BT基因水稻的检测方法。该方法简便快速、检测结果与标准及其他文献资料相符。     

产几丁质酶菌拮抗烟草黑胫病菌研究

从烟草根际土中分离筛选到两株产几丁质酶能力较高、对烟草黑胫病菌有稳定拮抗作用的菌株ZY-9-1和ZY-19-2。将两菌株发酵液用于烟草黑胫病菌的拮抗试验和初步大田防治试验并研究其对烟叶品质的影响,结果表明:在培养基平板上,量菌株发酵液对烟草黑胫病菌的生长有较好的抑制作用;菌株ZY-9-1和菌株ZY-19-2发酵液应用于大田后,对烟草黑胫病有一定的防治效果,防效分别达到56%和50%;试验样品经过常规化学分析和感官评吸,结果表明菌株发酵液对烟叶品质无不良影响。     

多重PCR法检测转Bar、Bt基因双抗稻米

旨在建立一种快速、有效的检测转基因双抗稻米的方法,以转Bar、Bt基因双抗稻米为原料,针对其水稻内源基因SPS和外源基因(包括Bar基因、Bt基因、CaMV35S启动子、Ubiquitin启动子和NOS终止子)设计多重PCR检测体系。结果表明,应用该多重PCR检测体系可快速检测出原料中的全部6条目标基因,检测灵敏度可达0.9%。     

烤烟烘烤过程中烟叶淀粉酶活性变化及色素降解规律的研究

采用河南农业大学设计制造的电热式温湿度自控烤烟箱,研究了烘烤过程中烟叶淀粉、淀粉酶和淀粉同工酶的变化,及对色素降解的影响。结果表明,在烟叶变黄阶段,淀粉急剧降解,48 h后基本趋于稳定;淀粉酶活性从烘烤开始逐渐升高,并于36 h前后达到一高峰,随后降低,在叶片水分40%~45%和环境相对湿度70%以上时,淀粉酶活性高,淀粉降解快,淀粉酶活性升高和淀粉相对降解量呈动态正相关(rNC89=0.7517*,r云烟85=0.4479),在叶片水分含量降至10%左右时,淀粉酶仍保持较高的活性,但降解量很小,含量几乎趋于稳定。淀粉同工酶电泳胶板上明显可见3条酶带A、B、C,初步确定为α-淀粉酶、β-淀粉酶、R-淀粉酶;β-淀粉酶活性最高,且同工酶活性和生理生化酶活性测定结果相一致。烘烤过程中淀粉和色素降解规律相同,数量变化呈极显著正相关rNC89=0.9649**,r云烟85=0.9428*。      

荧光定量PCR法定量检测混合烟叶中的红花大金元

为检测混合烟叶中红花大金元烟叶,设计了红花大金元品种特异性引物与TaqMan MGB探针,检测了引物和探针的特异性和灵敏性,确定了荧光定量PCR反应条件,并在此基础上建立标准曲线对混合烟叶中红花大金元单一品种进行定量检测。结果表明,引物与探针组合H1-R/F/T的特异性较好,建立了标准曲线方程,决定系数R2为0.997。当DNA（55 ng·μL-1）模板含量为2 μL时,红花大金元的检测限可达0.11 ng。利用该方法对混合烟叶样品中红花大金元含量进行检测,误差范围在2.5%~3.5%之间,表明该方法可应用于特定混合样品中红花大金元烟叶的定量检测。      

烟草蚜传病毒病的综合防治技术研究

在烟草炼苗期采用纱网罩、病毒抑制剂,大田期采用病毒抑制剂和推迟移栽期来防治烟草蚜传病毒病的结果表明,正确使用病毒抑制剂防治效果可达到60%左右,随移栽期推迟烟草蚜传病毒病发病显著减轻.炼苗期烟草苗床是传毒介体有翅蚜着落的靶子中心,此时正值有翅蚜迁飞第一高峰期,蚜虫带毒率较高,造成苗床大量未显症的带毒苗,是烟田蚜传病毒病的主要初侵染源,为防治烟草蚜传病毒病的关键时期.用纱网罩烟苗能阻止传毒介体与烟草接触交叉传染,移栽前后适时喷施病毒抑制剂,能有效地防治烟草蚜传病毒病发生,同时能有效地保护环境和介体天敌.     

Two-stage Nested PCR Effectiveness for Direct Detection of Vibrio vulnificus in Natural Samples

The nested primers designed to amplify a 222-base pair portion of the hemolysin gene, vvhA, were specific for all V. vulnificus strains tested. The nested PCR amplification, coupled with direct extraction of template DNA, revealed improved sensitivity sufficient for detection of 1 to 10 CFU V. vulnificus in 1 mL of seafood homogenates, and eliminated the need for enrichment culturing. Thereby, the nested PCR method achieved a broader applicability, making it effective for extensive use in identification of the pathogen in natural samples such as raw seafoods, seawater and sediments.     

PCR检测沙门氏菌invA基因的灵敏度

沙门氏菌是一种重要的肠道致病菌,其invA基因编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白,应用PCR扩增invA基因检测致病性沙门氏菌,并测定其PCR检测灵敏度。结果显示,扩增出的284bp大小的序列为目的条带,实验可检出的最小灵敏度为11.542pg。     

运用GIS技术提高我国烟叶质量数据科学价值初探

文中指出我国目前的烟叶质量数据存在几个不足之处:缺乏数字化的地理属性、缺乏高效管理与分析工具、对历史烟叶质量数据利用不够等。提出了运用现代信息技术去弥补这些不足的基本思路,并且采用2000年优质烟叶开发示范区的烟叶化学成分检测数据作了试验,研究结果表明,从理论上讲,运用现代信息技术去弥补目前烟叶质量数据的不足是完全可行的。      

溶藻弧菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

为建立溶藻弧菌（VA）的快速检测方法,本研究以VA Collagenase基因为靶基因设计合成引物及Taq Man探针,建立了实时荧光定量PCR快速检测VA的方法。结果显示,对15株实验菌株进行荧光定量PCR检测,只有VA菌株检测为阳性,表明该检测方法特异性强;该方法的灵敏度为18 cfu/m L;稳定性和重复性实验结果表明,同一样品重复检测4次Ct值的变异系数均小于2%;利用该检测方法对采集的165份样品进行检测,共计检出2份VA阳性样品,与SN/T2564-2010行标法检测结果一致,显示了良好的实用性。该检测方法灵敏度高、特异性强,具有良好的实用性。      

食用精炼大豆油DNA提取及单管巢式PCR检测

设计了针对转基因Roundup Ready大豆外源基因扩增的内外2对引物,分别位于CaMV35s启动子,CTP基因,CP4EPSPS基因区域,并成功对精炼大豆油中的外源基因进行单管巢式PCR检测。结果表明,用改良试剂盒法和冷冻干燥法提取大豆油中的DNA均可以满足单管巢式PCR检测要求;单管巢式PCR扩增对内外引物的Tm值有特殊要求,外引物的退火温度高于内引物。本实验建立的精炼大豆油转基因成分的单管巢式PCR检测方法特异性强,灵敏度高且快速方便。