黑曲霉液体深层发酵产纤维二糖酶的研究

纤维二糖酶（cellobiase）是纤维素酶系中的重要组分之一,目前由里氏木霉（Trichoderma reesei）生产的纤维素酶制剂中纤维二糖酶的活力明显偏低,限制了纤维素的糖化效率。本文采用一个黑曲霉菌株（Aspergillus niger ZU-04）,在液态发酵条件下生产纤维二糖酶,对主要的发酵工艺参数进行了研究,结果表明,培养基中添加1.0%的麸皮对纤维二糖酶的形成有明显的促进作用;葡萄糖、玉米浆粉的适宜浓度分别为2.0%、0.3%;变温培养缩短了产酶周期,培养4d,酶活力达到最高,为6.23IU/mL。采用黑曲霉纤维二糖酶与里氏木霉纤维素酶协同水解酸预处理后的玉米芯,当纤维素酶用量为20IU/g底物时,纤维二糖酶活力和滤纸酶活力比例为0.43,2d酶解得率达到91.1%。     

贻贝过氧化氢酶的纯化及部分性质

新鲜贻贝肉匀浆抽提液经硫酸铵盐析、ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ柱层纯化,得到一种过氧化氢酶。该酶为糖蛋白,亚基分子量约为７６０００,中性糖含量约为１０．５６％,研究结果表明,贻贝过氧化氢酶的最佳ＰＨ７．０左右,对热不稳定,４５℃保温１５ｍｉｎ,酶的残余活力约为７０％;６０℃保温１５ｍｉｎ,则酶的残余活力仅剩１０．６％左右。ＮａＮ３、ＫＣＮ及某些金属离子如Ｐｂ＾２＋、Ｈｇ＾２＋、Ｆｅ＾２＋、Ｃｄ     

黑曲霉HD9478纤维素酶固体发酵条件的研究

通过激光诱变筛选，获得一株高产纤维素酶的突变株ＨＤ９４７８，在以稻草，麦麸为主要原料的固体培养基上进行发酵培养，所产纤维素酶的固体曲，以羧甲基纤维钠为底物的纤维素Ｃｘ酶活力为３５００Ｕｇ，以滤纸为底物的纤维素ＣＬ的酶活力的２６０Ｕ／ｇ，以水杨素为底物的β－葡萄糖苷酶活力为１２００Ｕ／ｇ，发酵培养的条件是培养基起始ｐＨ６．０～７．０，培养温度２８～３２℃，培养时间７２ｈ。三种酶作用的最适ｐＨ分别为３     

里氏木霉91－3纤维素酶产生条件的研究

里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）Ａ＿３经亚硝基胍和紫外线复合处理，获得一株纤维素酶高产菌株９１－３。该菌株在最适固态发酵条件下，纤维素酶滤纸酶活力为１７０ｕ／ｇ曲，产酶水平是出发菌株的１．６倍。酶作用的最适条件为ｐＨ４．８，５０℃；ｐＨ稳定范围为３～７；９０℃处理７ｍｉｎ，酶活保存率为９１．６４％；室温放置半年，酶活保存率在９０％以上，室温放置一年，酶活保存率在８０％以上。     

里氏木霉91－3纤维素酶产生条件的研究

里氏木霉（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）Ａ＿３经亚硝基胍和紫外线复合处理，获得一株纤维素酶高产菌株９１－３。该菌株在最适固态发酵条件下，纤维素酶滤纸酶活力为１７０ｕ／ｇ曲，产酶水平是出发菌株的１．６倍。酶作用的最适条件为ｐＨ４．８，５０℃；ｐＨ稳定范围为３～７；９０℃处理７ｍｉｎ，酶活保存率为９１．６４％；室温放置半年，酶活保存率在９０％以上，室温放置一年，酶活保存率在８０％以上。     

黑曲霉固态培养生产纤维素酶的研究

黑曲霉突变株ＤＭ－１是一株产纤维素酶菌株，其中β葡萄糖苷酶活性特别高。采用粗纤维原料固体培养，发酵９６小时（培养温度３１℃），其滤纸酶活和β葡萄糖苷酶活分别为９５和１２００ｍｇ葡萄糖／ｇＤＭｈ。本试验系统研究了各种营养成份和培养条件对ＤＭ－１菌株产纤维素酶的影响。最适发酵培养基为：稻草杆（或麦杆）∶麦麸为６０∶４０、硫酸铵３．０、硫酸镁０．３、玉米浆３．０，加水２００％，自然ｐＨ；环境湿度８５％－９０％。酶反应最适温度和ｐＨ分别为５５℃－６０℃和ｐＨ５．０。酶ｐＨ稳定性较好，在ｐＨ３．０－８．０范围内处理１小时，残余酶活力在８５％以上，该酶经５５℃处理３０ｍｉｎ，剩余酶活力为８６．０％。     

β-葡萄糖苷酶产生菌的选育

对β－葡萄糖苷酶活力为０．４９７μｍｏｌ／（ｓ·ｇ）的无花果曲霉１０１菌株进行Ｃｏ６０及ＵＶ和ＮＴＧ诱变，得到一株产酶提高１．７２倍的Ｌ２菌株；再经发酵培养基及培养条件，包括碳源、氮源、有机酸、表面活性剂、金属离子、产酶诱导剂、培养温度、水分、初始ｐＨ值、通风量、接种形式及接种量等的优化，以优化得到的最佳条件固态发酵６ｄ，产酶稳定在４．１７～４．６７μｍｏｌ／（ｓ·ｇ）．     

植酸酶的研制与开发——菌种筛选与酶活的提高

对植酸酶产生菌进行了分离纯化，采用固体培养法生产植酸酶及对酶的性质进行了研究，研究结果表明，以麸皮：米糠＝４：６主要培养基成分，添加１％（ＮＨ４）２ＳＯ４，０．３％ＭｇＳＯ４，３０℃，恒温培养４ｄ后，其酶活可达４５８．７Ｕ，用含ＣａＣｌ２２％的ｐＨ５．０的醋酸缓冲液抽提效果好，酶的最适反应测度３５℃。     

选择性分离放线菌

进行了土样的预处理试验,探讨了平板培养基中抑制剂重酪酸钾的最适浓度．结果表明,选择性分离放线菌的比较适宜的方法为：采集的土样在２８℃或室温条件下风干１０～２０ｄ后,将土壤悬浮液（１０－１）于４０℃和ｐＨ７的条件下,加６％酵母膏和０．０５％ＳＤＳ（５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液）,震荡２０ｍｉｎ,水稀释至１０－２;或土壤悬浮液（１０－１）于５０℃和ｐＨ７的条件下,加６％胨和０．０５％ＳＤＳ（５ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液）,震荡１０ｍｉｎ,水稀释至１０－２．然后用平板稀释法接菌在高氏合成１号琼脂＋重酪酸钾（质量浓度为２５０ｍｇ／Ｌ）的平板培养基上,培养７ｄ后挑菌分离     

克鲁维酵母突变株UV-G-40-3菊粉酶性质的研究

研究了克鲁维酵母突变株（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ－ＵＶ－Ｇ－４０－３）所产菊粉酶的分布为胞外酶∶胞壁酶∶胞内酶比是５．７∶１．６∶１。该酶Ｓ／Ｉ为５．３,最适温度为５０℃,最适ｐＨ为４．５,在５０℃以下、ｐＨ４．５～８的范围内比较稳定,４℃贮存稳定性好,１４ｄ后仍保持７６％活力,为外切型菊粉酶,酶解粗菊糖（洋姜提取液）活性为纯菊糖的４倍。     

菌种接种方式对黄豆酱品质的影响

以沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉、AS 3.324甘薯曲霉、沪酿3.130毛霉、AS 3.972红曲霉、米根霉和枯草芽孢杆菌为菌种进行制曲、发酵,通过测定发酵7 d后蛋白酶活力和氨基酸态氮含量,研究单菌种制曲发酵、曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵方式对黄豆酱品质的影响。结果表明:曲料混合发酵产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量效果最好,其次为多菌种混合制曲发酵和单菌种制曲发酵。曲料混合发酵和多菌种混合制曲发酵中,2菌种和3菌种组合产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量整体较高,其中曲料混合发酵5号(沪酿3.042米曲霉、AS 3.35黑曲霉和枯草芽孢杆菌)产蛋白酶活力和氨基酸态氮含量最佳,分别达到713 U/mL和0.89 g/100 g。研究发现,沪酿3.042米曲霉成曲、AS 3.35黑曲霉成曲和枯草芽孢杆菌成曲按照曲料混合发酵方式接种更有利于得到品质较优黄豆酱。     

鸭蛋酱的双菌种制曲工艺

将鸭蛋蛋液用动物蛋白水解酶酶解后,添加黄豆、面粉制作鸭蛋酱,并通过正交试验对鸭蛋酱制曲的条件进行优化。采用米曲霉与黑曲霉混合菌种制曲,并通过对制曲过程中蛋白酶活力变化的分析,确定混合菌种发酵鸭蛋酱的最佳制曲温度、制曲时间、鸭蛋添加量及米曲霉与黑曲霉的配比。结果表明：最佳制曲条件是制曲温度30℃,鸭蛋添加量30%,米曲霉与黑曲霉的质量比为3:1,制曲时间48h,在此条件下,蛋白酶的活力最高,达到1465.81U/g。     

重组毕赤酵母发酵产纤维二糖酶

采用含黑曲霉(Aspergillus niger)纤维二糖酶基因的重组毕赤酵母发酵生产纤维二糖酶,对重组酵母的基因表达调控及发酵性能进行了研究。摇瓶试验结果表明:产酶培养基中甘油和玉米浆粉的适宜浓度分别为2.0%和3.0%,培养基最适pH值为6.0。甲醇作为碳源和基因表达的诱导物,对重组毕赤酵母的发酵结果有重要影响。发酵过程中每24h加入体积分数为1.0%的甲醇、质量浓度为0.2%的甘油及质量浓度为0.3%的玉米浆粉,有利于重组毕赤酵母持续合成纤维二糖酶。摇瓶发酵8d,发酵液中纤维二糖酶活力可达到9.01 IU/mL。     

多菌种混合制备高效酱油曲条件研究

以红曲霉、黑曲霉、米曲霉为菌种,采用固态发酵法来制备高效酱油酿造曲,以成曲中蛋白酶活为指标,考察了单菌种制曲工艺和多菌种组合制曲工艺的影响因素如培养时间、培养温度、润水量和无机盐等对蛋白酶活力的影响,并优化了多菌种混合制曲的条件.实验结果表明,多菌种制曲所得曲块质量比单菌种制曲的质量好.当红曲霉、黑曲霉和米曲霉混合制曲时,所得的曲块中蛋白酶酶活为633.42U/g,此曲块制备的优化条件是:培养时间为72h,培养温度为32℃,原料加水量为120%,硫酸锰添加量为0.05%,硫酸锌添加量为0.3%.     

利用玉米皮渣固体法酿造食醋的研究

研究了以玉米提取淀粉和蛋白后获取的玉米皮渣为糖化曲制备原料和食醋酿造原料，采用边糖化边酒化、再醋化工艺，固态法酿造食醋。结果表明：添加40％黑曲霉AS3．324糖化曲和60％黑曲霉HS-16糖化曲时的原料出醋率8．2kg／kg，产品质量符合GB18187—2000标准。     

人工发酵小麦酱生产工艺的研究

采用米曲霉、黑曲霉混合人工发酵小麦酱,通过单因素以及正交试验对影响小麦酱人工接种发酵工艺的因素,包括菌种接种量、食盐用量、发酵时间、发酵温度、乙醇用量进行优化筛选.最后确定最佳发酵工艺条件为:米曲霉和黑曲霉分开制曲,混合发酵,二者菌株添加比例为8∶1,接种量为0.3％,添加9％的食盐及0.5％的乙醇,在定期揿酱的前提下,28-40℃间歇式控温发酵35天;所得人工接种发酵产品氨基酸态氮值高,且感官评价较好,与传统自然发酵小麦酱风味相似.     

利用木糖渣生产酒精的研究

研究了纤维原料 (木糖渣 )的酶水解及产酒精工艺。结果表明 ,木糖渣的酶解得率受底物浓度及酶用量的影响较大 ,加入纤维二糖酶 (CB)会明显地提高酶解得率。当纤维素酶的滤纸酶活(FPA)与CB的比例为 4∶1时 ,10 %浓度的木糖渣酶解 48h还原糖得率可达 85 %～ 88%以上。同时 ,木糖渣产酒精结果表明 ,在不添加其他营养素 ,起始 pH 5 0 ,培养温度 3 2～ 3 4℃的条件下 ,10 %酶解液摇瓶发酵 3 6h ,酒精体积分数可达 2 5 13 %。按实验结果推算 ,3 98t木糖渣原料可生产 1t成品酒精。     

黑曲霉酸性β-甘露聚糖酶曲盘发酵与粗酶性质研究

用黑曲霉菌株(Aspergillus niger)LW—1进行固态发酵生产酸性β-甘露聚糖酶,其曲盘(大小φ20 cm×4 cm)发酵的最优工艺为:培养基最初料水比为1:1.8,起始pH自然,接种量10%(相对于干物料),曲盘中装料150g(以干料计),通过中间补水和翻曲,32℃培养72 h,最高酶活可达22 250 IU/g(干曲)。对粗酶性质进行研究,结果表明,酶的最适反应温度和pH分别为70℃和3.5,低于60℃、pH5.0～8.0酶稳定,Zn~(2+)、Ca~(2+)、ED- TA对酶有明显的激活作用;Mn~(2+)、Fe~(2+)、pb~(2+)、Sn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Al~(3+)、Ag~+对酶有一定的抑制作用。     

米曲霉固态发酵结合成曲水解法制备大豆抗氧化肽的研究

利用米曲霉固态发酵制曲结合成曲水解制备大豆抗氧化肽。分别以豆粕和麸皮为氮源和碳源,研究米曲霉制曲的原料碳氮比（cnq、制曲培养时间、曲精接种量对成曲水解特性（成曲蛋白酶活、水解度、肽得率、蛋白质回收率）及其水解产物抗氧化活性（抗氧化能力指数ORAC值、DPPH自由基清除率）的影响。在此基础上,通过正交试验研究四因素（包括pH、外源添加大豆分离蛋白、底物蛋白浓度和水解时间）对成曲水解产物抗氧化活性的影响,以期筛选出水解产物抗氧化活性较高的大豆肽。结果表明：制曲条件为：麸皮／豆粕质量比为l／5、培养时间44h、曲精接种量0．05％（m/m）;成曲水解条件为：pH7、底物蛋白浓度8％、不添加外源蛋白、水解4h时,所得成曲的碱陛蛋白酶活力可高达3109．85U／g,曲水解产物的ORAC值可高达2130．22ImaolTroloxequivalent／gpeptide,DPPH的IC50值为0．29mg／mL,具有强抗氧化活性。