γ射线诱导人肿瘤细胞B7.1分子表达的研究

为研究电离辐射与人肿瘤细胞B7．1分子表达之间的关系，探讨肿瘤细胞在照射后免疫原性增强的机理。采用间接免疫荧光－流式细胞仪测定技术，用30、40、50、60Gyγ射线照射5种肿瘤细胞和一种非肿瘤细胞后，观察不同培养时间（24、48、72、96h）内这些细胞B7．1分子的表达水平。用^3H－TdR释放试验测定肿瘤细胞和淋巴细胞共反应后细胞毒活性。结果表明，未经熙射的肿瘤细胞不表达B7．1分子。经40Gy照射后，SMMC－7721肝癌细胞、PC－12嗜铬神经瘤细胞、A－549肺癌细胞表达B7．1共刺激分子，与对照组相比有非常显著性差异，但SHG胶质瘤 细胞和HOS骨肉瘤细胞经60Gy照射后仍未B7．1分子的表达。淋马细胞与表达B7．1分子的肿瘤细胞共反应后细毒胞活性明显高于未照射组（p＜0．01）。实验提示，γ射线能诱导人肿瘤细胞表达B7．1分子，增强肿瘤细胞的免疫原性。     

整体照射后胸腺细胞和脾细胞p16基因转录和蛋白表达的变化

研究X射线全身照射对小鼠胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达的影响。采用Northern blot检测p16基因转录水平的变化;采用流式细胞术检测蛋白表达的变化。时程结果表明,2.0Gy照射后4-24h,胸腺细胞p16mRNA水平明显增高,8-48h P16蛋白表达显著增高(p<0.05-p<0.01);照射后4-8h脾细胞p16mRNA水平明显增高,24h P16蛋白表达显著增高(p<0.05)。量效结果表明,0.5-6.0Gy照射后,胸腺细胞p16mRNA水平呈剂量依赖性增高,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01);脾细胞p16mRNA水平亦增高,但增幅远低于胸腺细胞,P16蛋白表达在1.0-4.0Gy组明显高于假照射组(p<0.05-p<0.01)。X射线全身照射可诱导胸腺细胞和脾细胞p16基因转录及蛋白表达增高。p16表达参与整体照射诱导细胞G1期阻滞的分子调控。     

辐射对免疫功能影响的研究

本文作者应用同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷(~3H-TdR)掺入法测定植物血凝素(PHA)、葡聚糖硫酸盐(DS)两种丝裂原刺激下的T、B淋巴细胞转化试验,各种花环试验(ERFC、ERFC、ZC_3RFC、M_ERFC、EA_GRFC和EA_MRFC),非特异性酯酶染色(ANAE)及淋巴细胞乳酸脱氢酶(LDH)同功酶谱的测定等指标,观察电离辐射对淋巴细胞及其亚群的辐射效应。主要结果如下: 1.淋巴细胞是具有高度辐射敏感性的不均一群体。总的说来,B细胞辐射敏感性高于T细胞;Tγ细胞的辐射敏感性比Tμ细胞高。 2.T、B淋巴细胞非特异性转化反应是一项辐射敏感性较高的指标,B细胞转化反应对辐射效应比T细胞转化反应更为敏感。 3.电离辐射对ANAE活性和E花环形成率均有显著抑制作用,但对ANAE活性的抑制较对E花环形成率的抑制更为显著,提示ANAE染色更能反映T胞细的辐射损伤效应。 4.T、B淋巴细胞在中等剂量照射后,LDH_5含量相对百分比都见增高,但T细胞LDH_5百分比的升高与对照组之间的差别无统计学意义。B细胞经2.5或5.0Gy照射后LDH_5百分比升高与对照组之间差别显著(P<0.05)。这种T、B细胞照射后LDH_5变化的不同,提示B细胞辐射敏感性可能高于T细胞。 5.淋巴细胞中各种RFC数随照射剂量的增加而下降,且具有时相性变化。各种RFC的D。值变化顺序为ERFC>ZC_3RFC>E_     

X射线照射后EL-4细胞p16mRNA和P16蛋白表达的变化

采用RT?PCR(逆转录聚合酶链反应)半定量方法检测p16基因转录水平的变化,采用免疫细胞化学方法检测蛋白表达,观察X射线照射对离体培养的EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达的影响,证实p16基因转录表达在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中的重要作用。结果表明,2.0GyX射线照射后2—48h,EL?4细胞p16mRNA水平增高,照射后72h恢复正常水平。P16蛋白表达于照射后2h开始增高,照射后12hP16蛋白表达非常显著高于对照组(p<0.01)。剂量?效应实验表明,0.5—6.0GyX射线照射后12h,?4细胞p16mRNAEL水平明显提高。2.0、4.0、6.0Gy组P16蛋白表达均非常显著增加(分别p<0.01)。研究证实,电离辐射能够诱导EL?4细胞p16基因转录及蛋白表达增高,其增幅呈现明显的剂量依赖性。提示辐射诱导p16基因转录表达增加在辐射诱导EL?4细胞G1期阻滞中发挥重要作用。     

用单克隆抗体(McAb)及美洲商陆(PWM)研究淋巴细胞及其亚群的辐射效应

用三株单克隆抗体(McAb):T_4、T_8和HI_(43)研究不同剂量~(60)Coγ线照射对人外周血淋巴细胞亚群的辐射效应;玫瑰花环法分离T、B淋巴细胞;T_4McAb标记淋巴细胞,经细胞亲和层析得到T_4~ 和非T_4~ (即去除了T_4~ 亚群的淋巴细胞)细胞。部分T、B、T_4~ 和非T_4~ 细胞接受10Gy~(60)Coγ线照射,随后各种细胞匹配分组配养,以~3H-TdR掺入法观察PWM对淋巴细胞及其亚群的激活功能及(60)Coγ线的辐射效应。结果表明:T_4~ 、T_8~ 和HI_(43)~ 细胞受到0.1Gy(60)Coγ线照射后即刻(1小时之内)间接免疫荧光试验就可呈现非常显著的辐射效应,T_8~ 和HI_(43)~ 的辐射敏感性高于T_4~ 亚群。T、B淋巴细胞均可被PWM所激活,后者强于前者;PWM对B和非T_4~ 细胞激活作用相当,唯T_4~ 细胞最弱。T细胞和T_4~ 细胞与B细胞均有协同作用。前者与B细胞的协同作用更大。当T、T_4~ 细胞或B细胞受到10Gy(60)Coγ线照射后,它们之间的协同作用消失。非T_4~ 细胞与B细胞既无协同作用也无抑制作用。受10Gy(60)Coγ线照射后,T_4~ 亚群~3H-TdR掺入CPM减少没有B和非T_4~ 细胞严重,后二者差别无显著性。     

Ⅱ.自然杀伤细胞毒因子

人扁桃体淋巴细胞经不同剂量(0～40Gy)γ时线照射并用PHA刺激,在不同培养时间(4～96h)内,以MTT法测其上清液中HKCF活性。结果表明:(1)经2.5～40Gy照射,NKCF活性仅被轻度抑制;(2)经48～96h培养后的上清液中NKCF活性明显高于24h培养后的上清液中的。照射剂量与培养时间对NKCF的产量变化没有交互影响。本文报道的NK细胞抗辐射的结果与文献报道的结果相近,而且被慢性炎症激活的扁桃体NK细胞具有更高的抗辐射能力。     

人扁桃体细胞经γ射线照射后产生淋巴因子能力的变化 Ⅱ.自然杀伤细胞毒因子

人扁桃体淋巴细胞经不同剂量(0～40Gy)γ射线照射并用PHA刺激,在不同培养时间(24～96h)内,以MTT法测其上清液中NKCF活性。结果表明:(1)经2.5～40Gy照射,NKCF活性仅被轻度抑制;(2)经48～96h培养后的上清液中NKCF活性明显高于24h培养后的上清液中的。照射剂量与培养时间对NKCF的产量变化没有交互影响。本文报道的NK细胞抗辐射的结果与文献报道的结果相近,而且被慢性炎症激活的扁桃体NK细胞具有更高的抗辐射能力。     

4GyX射线照射对EL-4细胞cyclin B1及cdc2 mRNA水平的影响

采用流式细胞术和半定量 RT-PCR 的方法分别检测 4Gy X 射线照射后 EL-4 细胞不同细胞周期时相和EL-4 细胞内 cyclin B1 及 cdc2 mRNA 水平的时程变化,以探讨 X 射线照射诱导 EL-4 细胞 G2 期阻滞的分子调控机制。 结果表明,4Gy X 射线照射 EL-4 细胞后 2h,G2期细胞开始明显增多,4—8h 达峰值(p<0.001)。EL-4 细胞内 cyclin B1 mRNA 水平于照射后 1h 开始下降,24h 降至最低值,为假照组的 57.7 %,72h 恢复至正常水平。EL-4 细胞中 cdc2 mRNA 水平于照射后 12h 开始降低,24—48h 降至最低水平,分别为假照组的59.2% 和 58.9%,72h 恢复至假照组水平。结果提示, 4Gy X 射线照射可诱导 EL-4 细胞 cyclin B1 及 cdc2 mRNA水平明显下降,直接导致 MPF 活性减少是引发 G2 期阻滞的关键。     

12C6+照射对小鼠睾丸组织脂质过氧化、SOD活性及细胞周期的影响

为评估重离子照射的生殖毒性,探讨其损伤的可能机制,用0、0.5、1、2或3Gy剂量12C6 离子对性成熟昆明雄鼠下腹部进行局部照射,6h后处死小鼠,取睾丸组织,用流式细胞术检测睾丸细胞凋亡率和细胞周期,用化学试剂盒检测组织中超氧化物岐化酶(SOD)的活性以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)水平.结果表明,与对照组(0Gy)相比,低剂量照射(0.5Gy)组中睾丸组织SOD活性增加(P>0.05),但SOD活力随剂量增加而下降,在2Gy和3Gy照射组中呈显著抑制作用(P<0.05);睾丸组织中MDA含量随剂量增加,2Gy和3Gy照射组呈显著性差异(P<0.05).流式细胞术检测结果显示,1～3Gy 12C6 照射可导致睾丸组织中单倍体、二倍体及四倍体细胞数量显著减少(p<0.01),凋亡率明显增加(p<0.01)以及G2/M期阻滞(p<0.01).提示12C6 照射可能通过自由基损伤途径,诱发细胞凋亡和细胞周期异常,从而造成睾丸组织损伤,生殖能力下降.本实验结果为抗氧化剂和自由基清除剂用于临床重离子治疗中对性腺的防护提供了理论依据.     

~(60)Coγ射线整体照射对小鼠肠系膜淋巴结淋巴细胞在体内原发移行的影响

本文用~(51)Cr 标记细胞方法,研究了经~(60)Coγ射线整体照射后小鼠肠系膜淋巴结(MLN)淋巴细胞在同系受体小鼠体内的原发移行。结果表明,供体小鼠经0.5—4Gy~(60)Coγ射线整体照射后,其 MLN 淋巴细胞在同系正常受体体内的原发移行有很大改变。在4Gy 照射组,受体肝脏的标记细胞显著增多;脾脏的标记细胞量在各剂量组均无显著性改变 MLN、肺、回肠的标记细胞量分别在0.5Gy、1Gy、1Gy 照射后开始出现显著性降低。     

人扁桃体细胞经γ射线照射后产生淋巴因子能力的变化 Ⅰ.白细胞介素-2

人扁桃体细胞经不同剂量(0～40Gy)γ射线照射后,用PHA刺激,在不同培养时间(24～96h)内,以MTT法测其上清液中IL2活性。结果显示:(1)照射2.5Gy,IL2活性下降,5～20Gy范围内,活性维持在一定水平,照射40Gy,活性显著下降;(2)48～96h的培养上清液中IL2活性呈现持续高水平。照射剂量与培养时间对IL2的产量变化没有交互影响。本文结果与文献报道的辐射促使人外周血淋巴细胞IL2产量增加的结果不同,可能是扁桃体中T细胞亚群的组成、分布及功能与外周血不同,因此对辐射的敏感性也有差异。     

N-乙酰半胱氨酸对HT22细胞辐射诱导氧化应激及增殖和凋亡的影响

为探讨N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)对辐射相关氧化应激和海马神经元HT22细胞的增殖及凋亡的影响。首先选用不同剂量(0、2、4、6、8、10、12 Gy)的X射线分别照射HT22细胞,筛选出最佳照射剂量(10 Gy),然后进行实验分组:空白对照(Control)组,单纯照射(RT)组,照射+NAC(RT+NAC)组,照射后继续培养24 h后,CCK-8法检测细胞增殖、AnnexinV/PI双标记流式细胞术检测细胞凋亡情况;DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平以评估细胞内氧化应激程度,比色法测定细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性,Western blot检测Cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达变化。结果表明,(1)2 Gy的照射对细胞增殖的影响不明显,当辐射剂量大于2 Gy时,随着辐射剂量的增高,HT22细胞增殖率明显降低(p<0.05);辐射剂量达10 Gy时,细胞增殖抑制率接近50%,因此将10 Gy作为实验最佳辐射剂量。(2)给予10 Gy X射线照射前给予NAC预处理可明显增加HT22细胞的增殖率(p＜0.01)。(3)给予10 Gy X射线照射可明显增加细胞内ROS、MDA含量(p＜0.01),减少细胞内GSH含量和SOD的活力(p＜0.01),促进凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3的表达(p＜0.01),细胞凋亡率显著增加(p＜0.01);NAC可减少照射后细胞内ROS和MDA含量(p＜0.01),提高GSH水平及SOD活性(p＜0.01),显著减少凋亡蛋白的表达和细胞凋亡。以上结果表明NAC可抑制辐射相关氧化应激,减少辐射对HT22细胞增殖抑制,减少细胞凋亡。     

~(238)Pu α粒子体外照射肺巨噬细胞的生物效应及致肺成纤维细胞恶性转化的实验研究

本文综合报道了~(238)Puα粒子体外照射所致肺巨噬细胞(AM)及类巨噬细胞系 P388D_1细胞免疫功能的改变以及对肺成纤维细胞恶性转化的剂量效应关系的实验研究结果。从卡介苗(BCG)激活的大鼠肺中灌洗出的肺巨噬细胞,在体外经~(60)Co γ射线照射后,对 Hela 细胞和人肺腺癌细胞的细胞毒效应降低,降低程度与剂量(100—500Gy)呈依赖关系,同时还看到 AM细胞膜完整性的损伤。以类巨噬细胞系 P388D_1细胞作为 AM 的模拟细胞,在体外经~(238)Puα粒子照射(0.3—6.0Gy)后,观察到 EA 花环形成率、特异吞噬功能在受到0.3Gy剂量照射后受抑制,且抑制程度与剂量有依赖关系,细胞膜也受到损伤。在培养体系中加入膜保护剂——硒后,上述两类细胞的免疫功能抑制程度减轻,提示膜的完整性在巨噬细胞的免疫功能表达中起重要作用。文中还对AM 在辐射诱发肺癌中的作用进行了讨论。用~(238)Puα粒子和 X 射线分别照射成年大鼠肺成纤维细胞系(WAL-F_1),其剂量分别为0.01—1.5Gy 和0.5—5.0Gy,进行形态转化、ConA 凝集试验、染色体畸变、半固体琼脂培养集落形成以及转化细胞移植后的致癌性等方面的实验观察。结果证实 X 射线和α粒子均可诱发 WAL-F_1细胞恶性转化,以 X 射线为参比.~(238)Puα粒子的 RBE 约为6。最后还讨论了辐射诱发体     

不同剂量电离辐射对小鼠树突状细胞(DC)表型及功能的影响

采用流式细胞术和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测0.075 Gy及2.0 Gy X射线照射6、12、24、48、72 h后DC/TLC共培养体系中小鼠树突状细胞(DC)表面CD80、CD40分子表达及其分泌细胞因子IL-12、IL-27的变化,探讨电离辐射对DC在免疫反应中的作用。结果显示共刺激分子CD80和CD40及细胞因子IL-12在0.075 Gy照射后与对照组相比表达量均升高,而2.0 Gy照射后其表达量则降低;但IL-27在高、低剂量照射后其表达量均增加。上述结果表明,电离辐射在体外可以诱导DC表型变化及细胞因子分泌的变化,该结果将为辐射免疫效应提供新的实验依据。     

Egr-IFNγ重组质粒的构建和在B16细胞中的辐射诱导表达

小鼠IFNγ cDNA基因连接到Egr-1启动子的下游构建成Egr-IFNγ重组质粒,利用质脂体介导转染B16细胞,用ELISA方法检测x射线照射后IFNγ表达的剂量效应和时程。结果表明,实验组的表达水平明显高于对照组,其中20Gy和2Gy照射组高于其它实验组(p<0.01)。26y照射后6h IFNγ表达量最高(p<0.01)。转染后的B16细胞每隔24h接受2Gy x射线照射,结果显示第一次照射后表达量最高(p<0.01),然后逐渐降低。结果提示电离辐射可激活Egr-IFNγ重组质粒,并调节IFNγ基因表达,这项研究可能对肿瘤治疗的研究有一定的意义。     

西咪替丁对伽马射线辐照小鼠免疫功能的保护作用

雄性C57小鼠60只平均分为6组:正常对照组(0 Gy)、模型对照组(1.0 Gy)、阳性药对照组(1.0 Gy+523片)、西咪替丁(Cimetidine,CMD)低、中、高剂量组(1.0 Gy+33.3、1.0 Gy+100、1.0 Gy+300 mg/kg),采用60Cog射线全身照射至吸收剂量1.0 Gy,剂量率为8.33 m Gy/min。CMD于照射前连续灌胃给药6 d,每天1次,照射后5 h给药1次。照射后24 h检测脾脏淋巴细胞凋亡率、T淋巴细胞亚群、B淋巴细胞数和血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IFN-g和TNF-α含量。结果表明:与正常对照组比较,照射后24 h,小鼠脾脏淋巴细胞凋亡率显著增加(p0.01),CD3~+、CD3~+CD8~+T细胞和CD3~-CD19~+B细胞数量均下降(p0.01),血清中的IL-4、IL-12和TNF-α含量显著降低(p0.01,p0.05);与辐照模型组比较,CMD各剂量组脾脏淋巴细胞凋亡率显著下降(p0.01),CMD给药组血清中IL-4、IL-6、IL-12、TNF-α和(40)FN-g含量显著增加(p0.01,p0.05),CMD高剂量组的CD3~+、CD3~+CD4~+和CD3~+CD8~+T细胞及CD3~-CD19~+B细胞数量均显著上升(p0.01,p0.05)。结果提示,CMD可有效改善g射线辐照小鼠的免疫功能,具有较好的辐射保护作用。     

低剂量辐射诱导小鼠胸腺细胞周期进程的适应性反应

观察低剂量辐射诱导小鼠胸腺细胞周期进程适应性反应的剂量、剂量率和时间效应。用诱导剂量(D1:25、50、100、200mGy,剂量率:12.5mGy/min;;D1:75mGy,剂量率:6.25、12.5、25、50、100、200mGy/min)和攻击剂量(D2:1.0、1.5、2.0Gy,剂量率:287mGy/min)照射Kunming雄性小鼠,D1和D2间隔3、6、12、24、60h。用流式细胞仪检测胸腺细胞周期各时相细胞百分数。当D1为25、50、100mGy(剂量率:12.5mGy/min,D1和D2间隔6h),或D1为75mGy(剂量率:6.25、12.5、25mGy/min,D1和D2间隔3、6、12h),D2为1.0、1.5、2.0Gy,D2组与假照射组之比S期胸腺细胞百分数明显降低(p<0.05或p<0.01),而G0/G1和G2 M期细胞百分数明显增加(p<0.05或p<0.01);;但D1 D2组与D2组之比S期细胞百分数明显增加(p<0.05或p<0.01),而G0/G1和G2 M期细胞百分数不同程度降低。小鼠接受1.0—2.0Gy(287mGy/min)照射前3—12h受25—100mGy(6.25—25mGy/min)照射,可诱导胸腺细胞周期进程的适应性反应。     

致死剂量γ射线照射小鼠淋巴结淋巴细胞凋亡动力学及其与相关蛋白表达的关系

用原位末端标记、原位杂交和碱磷酶免疫组化技术,观察致死剂量γ射线照射小鼠淋巴结淋巴细胞的凋亡动力学变化,及其与Bax、Bcl-2和Bcl-XL表达的关系。结果表明,照射后24h淋巴结淋巴细胞凋亡指数迅速升高,在6—12Gy范围内与照射剂量呈正比,≥15Gy照射后变化不明显。6Gy照射后24h,淋巴细胞凋亡达高峰,尔后开始降低;然而直至照射后6个月和12个月,凋亡指数仍明显高于对照组。6Gy照射后24h,淋巴细胞Bax蛋白表达即出现升高,当剂量为12Gy时达到峰值,15Gy和20Gy照射后未观察到这种剂量效应关系。而Bcl-2和Bcl-XL蛋白表达在照射后24h明显下降。bax和bcl-2mRNA的表达显示出相似趋势。以上结果显示,≤12Gy照射后细胞凋亡是淋巴细胞的重要死亡方式。照射后Bax的上调及Bcl-XL的下调在致死剂量照射引起的淋巴细胞凋亡调控中起重要作用。     

白介素-6对受分次照射荷瘤小鼠脾细胞的辐射防护作用

探讨白介素-6(IL-6)对受照射荷瘤小鼠脾脏的辐射防护作用。6MV X射线对荷瘤小鼠进行分次全身照射(5Gy/5f/5d)后,采用黄嘌呤氧化酶法测定脾组织血清超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,硫代巴比妥酸钠(TBA)荧光法测定氧化产物丙二醛(MDA)含量;免疫组化抗生蛋白链霉素-过氧物酶-生物素(SP)法检测脾细胞Bcl-2的表达;Beckman液体闪烁仪检测脾淋巴细胞亚群对K562细胞的杀伤活性。结果表明, IL-6组脾组织T-SOD含量明显增高(p<0.01),而MDA含量明显降低(p<0.05); IL-6组脾细胞Bcl-2的表达水平显著高于对照组(p<0.01);IL-6提高了脾淋巴细胞对K562细胞的杀伤活性。抗氧化酶活性的降低和氧自由基作用的增强是电离辐射引起细胞过氧化损伤,导致细胞功能异常的重要原因。IL-6可能通过促进脾细胞Bcl-2蛋白表达,增强脾细胞的抗氧化活性,抑制氧自由基对脾细胞的损伤,延长脾细胞寿命,增强其免疫功能而发挥辐射防护作用。     

小剂量辐射诱导的免疫增强效应及其细胞学机制

在研究小剂量X射线照射对全淋巴细胞刺激效应的同时,探讨了小剂量照射(0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.50Gy)对三种单克隆抗体分离出的CD_4~ 、CD_8~ 和B亚群细胞的刺激效应,观察了小剂量照射后的CD_4~ 、CD_8~ 细胞对B细胞功能的影响。结果表明,Panning法分离的各亚群细胞的纯度和存活率均在90％以上,全淋巴细胞在0.10Gy剂量内有刺激作用,尤以0.10Gy剂量点效应最大(为对照组的139.2％);各亚群细胞在0.20Gy照射内,均有刺激效应的发生,CD_4~ 和B细胞在0.10Gy剂量点效应最强(为对照的179.3％和182.5％),而CD_8~ 在0.05Gy点效应最强(为对照的169.6％);相同剂量,CD_4~ 和B细胞的刺激效应大于CD_8~ 。0.50Gy照射则表现出明显的抑制作用。正常CD_4~ 细胞对B细胞具有辅助功能,CD_8~ 细胞对B细胞具有抑制作用,小剂量照射可加强CD_4~ 细胞对B细胞的辅助作用,促进CD_8~ 细胞对B细胞的抑制功能,以0.10Gy照射后这种效应最强,0.20Gy照后仍可观察到这种效应。