γ-谷氨酰转肽酶的酶学性质及其转肽反应机制

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)能专一地催化γ-谷氨酰基的转移,在γ-谷氨酰基类衍生物的合成方面具有重要的应用价值.今利用Bacillus subtilis NX-2发酵生产GGT,上清液中的GGT经硫酸铵沉淀后,以DEAE Sepharose FF和 Source 15 Q 两步离子交换进行纯化.以γ-D-Gln-L-Trp(SCV-07)为目的产物,研究了GGT的基本酶学性质,确定了其最适反应温度为40 ℃,最适Ph值10.0, 供体/受体浓度为5:7,最适反应时间为4 h,产物转化率可高达42%.结合反应进程曲线,分析了GGT的作用机制,并通过实验证实了GGT不仅具有转肽活性,还可催化产物的不可逆水解,这是导致产物回收率下降的关键原因.经测定得到GGT的转肽反应米氏常数(Km)为5.08 mmol·L-1,最大反应速率(rmax)为0.034 mmol·(min·L)-1;对γ-D-Gln-L-Trp的水解反应米氏常数(Km')为2.267 mmol·L-1,最大反应速率(rmax')为0.012 mmol·(min·L)-1.     

固定化γ-谷氨酰转肽酶催化合成γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸

以环氧基树脂Eupergit C250L为载体对B.subtilis NX-2 GGT进行了共价固定化.固定化酶的最适作用pH为9.0,最适作用温度为60℃.固定化酶的热稳定性和贮存稳定性均较游离酶有显著的提高,经100 d 20个批次转化后,固定化残余酶活仍能保持初始值的80%左右.以固定化酶为催化剂,在反应条件为L-谷氨酰胺(Gln)20 mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-Bzl-cys)20 mmol/L、酶浓度0.0375 U/mL和pH 9.0条件下,40℃水浴反应22 h,转肽产物S-苄基-y-L-谷氨酰-L-半胱氨酸(S-Bzl-GGC)得率为4.3 mmol/L,较游离酶提高了11.96%.S-Bzl-GGC经酸解脱除保护基后可得γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酸,产物纯度可达94.1%.     

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌来源γ-谷氨酰转肽酶的克隆表达和性质比较

γ-谷氨酰转肽酶(GGT)是生物体内谷氨酰循环的关键酶,在生物有机合成领域具有重要的应用价值。今建立了大肠杆菌和枯草芽孢杆菌GGT的克隆、重组及诱导表达方法。在此基础上,分别考察了重组大肠杆菌GGT(rE_GGT)和重组枯草芽孢杆菌GGT(rB_GGT)的催化特性和稳定性。结果表明,rE_GGT对供体对硝基苯胺(GpNA)的亲和力(Km)优于rB_GGT,但rB_GGT的催化常数(kcat)高达3.48×105 s?1,是rE_GGT的20倍。稳定性研究表明,rE_GGT在pH 6~9和T45℃条件下的稳定性明显优于rB_GGT;但当温度超过45℃时,rB_GGT的稳定性更佳。通过对rE_GGT和rB_GGT的氨基酸组成及其大、小亚基界面相互作用力的分析表明,rE_GGT大小亚基间疏水键的数目明显多于rB_GGT,有助于稳定其四级结构,使其在中低温下具有良好的稳定性;而rB_GGT氨基酸组成中荷电残基和芳香族残基的比例较高,可有效维持其二级结构的稳定性。     

WRK对枯草芽孢杆菌NX-2产出的γ-谷氨酰转肽酶的不可逆抑制动力学

γ-谷氨酰转肽酶(GGT;EC2.3.2.2)催化的酰基转移反应可用于制备各种具有生理活性的谷氨酰化合物,对其开展酶活力不可逆抑制动力学研究对于阐明GGT的作用机制具有重要意义。今以化学抑制剂Woodward's Reagent K(WRK)与枯草芽孢杆菌NX-2产出的GGT进行不可逆抑制反应,根据邹氏理论测得WRK对GGT不可逆抑制反应的微观速率常数ki为0.03015s-1,WRK与酶结合常数KI为1.352mmol·L-1。有抑制剂存在下GGT与供体γ-谷氨酰对硝基苯胺的亲和力常数Km*=3.245mmol·L-1,GGT酰基化最大反应速度Vmax*=0.3771mmol·(L·s)-1。通过对GGT的失活动力学分析得到,失活反应级数为1.313,说明在GGT活性部位至少有一个谷氨酸(或天冬氨酸)残基参与催化反应。     

γ-聚谷氨酸的合成、化学修饰及其应用进展

γ-聚谷氨酸是一种水溶性、可生物降解、可食用的对人和环境无毒的生物大分子,已广泛用于农业、水处理、化妆品、食品、医药等领域,其酯化物可以成膜、成纤维.介绍了γ-聚谷氨酸的合成方法、化学修饰及相关应用.     

有序介孔TiO2固载γ-谷氨酰转肽酶催化合成S-bzl-γ-Glutamyl-L-Cysteine

以有序介孔TiO2(OM-TiO2)为载体对B.subtilis NX-2GGT进行吸附固载.圆二色光谱分析和活性位点滴定结果表明,固定化前后酶的二级结构和活性位点数变化很小,固定化后GGT对供体的亲和力及转肽反应催化常数均有不同程度下降,但固定化酶对产物的亲和力有明显提高.固定化后GGT的热稳定性和pH稳定性均较游离酶有显著提高,固定化酶稳定性良好,经10批次转化后,固定化催化活性仍保持74%.以固定化GGT为催化剂,在L-谷氨酰胺(L-Gln)5mmol/L、S-苄基-半胱氨酸(S-bzl-cys)15mmol/L、酶浓度0.062U/mL和pH9.0条件下,40℃水浴反应5h,产物浓度为1.2mmol/L.     

Ca2+对枯草芽孢杆菌γ-谷氨酰转肽酶活性和热稳定性的影响

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspeptidase,GGT)可将γ-谷氨酰基从酰基供体催化转移至相应的受体上,形成新的γ-谷氨酰基化合物.今针对GGT稳定性差的缺陷,采用添加Ca2+的方法对其进行稳定化.研究了Ca2+对枯草芽孢杆菌GGT活性及热稳定性的影响.以4 mmol·L-1 CaCl2于37℃下...     

α-乙酰基-γ-丁内酯合成新工艺研究

以γ-丁内酯,乙酸乙酯为原料,金属钠和乙醇钠为催化剂,甲苯为溶剂合成α-乙酰基-γ-丁内酯。在金属钠与乙醇钠的钠摩尔比为7:3,甲苯/γ-丁内酯(w/w)=2.51,反应温度85~90℃,反应时间5h,n(乙酸乙酯):n(GBL):金属钠为2.27:0.9:1的条件下;GBL转化率≥98%,ABL收率≥95%。     

γ-氨基丁酸(GABA)在农业生产中的应用

γ-氨基丁酸在植物生长过程中发挥重要作用.综述了γ-氨基丁酸的性质及其合成方法,介绍了γ-氨基丁酸作为植物生长调节剂在农业生产中的应用,分析了γ-氨基丁酸在逆境条件下对农作物生长发育的促进作用,为推动γ-氨基丁酸在农业生产的应用提供参考.     

γ-丁内酯制备α-乙酰-γ-丁内酯的探讨

探讨了在醇钠的催化作用下,以γ-丁内酯(GBL)和醋酸乙酯缩合制取α-乙酰-γ-丁内酯(ABL)的可行性。在带搅拌的间隙式反应釜中,用正交试验设计和单因素试验研究了反应温度、进料摩尔比和反应时间以及醇钠用量对ABL收率的影响,获得了主要工艺参数。结果表明:在相同条件下,影响收率的主要因素是反应温度和反应时间。     

酶法制备γ-D-glutamyl-L-tryptophan的动力学模型

以酶法合成γ-D-glutamyl-L-tryptophan (γ-D-Glu-L-Trp)为研究体系,采用D-谷氨酰胺为γ-谷氨酰基供体,L-色氨酸为受体,测定得到了转肽反应的米氏常数（K _m）为5.11 mmol·L^-1,催化常数（K_cat）为3.92 mmol·min^-1,γ-D-Glu-L-Trp的水解反应米氏常数（K′_m）为2.31 mmol·L^-1,催化常数（K′_cat）为1.46 mmol·min^-1。采用顺序反应机制建立了酶法制备γ-D-Glu-L-Trp的过程动力学模型,并进行了参数优化。经验证,所建模型可准确预测该体系中的反应进程,模型数值解与实验值的平均相对误差小于5%。     

γ-丁内酯类化合物的合成与应用

γ－丁内酯及其衍生物是一类重要的精细化学品，它们被广泛用于食用，日用香精，制药等领域，本文着重阐述γ－丁内酯及其一些重要衍生物的合成与应用。     

(S)-(+)-γ-苄氧基甲基-γ-丁内酯的合成研究

以Ｌ 谷氨酸为原料,首先在－５～０℃条件下重氮化,随后常温内酯化,然后在对甲苯磺酸催化下于苯中回流进行酯化,用硼氢化钠在常温下还原,最后用氧化银作为碱发生常温威廉逊（Ｗｉｌｉａｍｓｏｎ）醚化反应,以３２３％的总产率合成了标题化合物。     

α-乙酰基-γ-丁内酯的合成及进展

简要介绍了α乙酰基γ丁内酯的合成方法, 指出了以乙酰乙酸乙酯和环氧乙烷为原料的生产方法的不足, 简述了以γ丁内酯和乙酸乙酯为原料的工艺路线的应用前景。     

γ-聚谷氨酸的生产及应用研究进展

综述了γ-PGA的生产方法以及其应用领域。γ-聚谷氨酸是由微生物合成的可降解的生物高分子。由于其水溶性好、可吸附重金属、及对人体和环境无毒,在医药、环境保护、农业和食品等领域具有广泛的应用前景。     

α-乙酰基-γ-丁内酯的合成优化

α-乙酰基-γ-丁内酯是医药和农药中重要的合成中间体,由于其用途被不断的开发,从而使其市场需求也不断扩大,因此,对其进行研究具有重要的意义。主要研究了α-乙酰基-γ丁内酯的合成优化。     

γ-溴代丁酸乙酯的合成

γ-丁内酯在乙醇中HBr解合成γ-溴代丁酸乙酯,HBr气体在反应混合液中直接产生,不需要专门的气体发生装置。     

γ-氨基丁酸的应用及生产前景展望

γ-氨基丁酸(简称GABA)是哺乳动物中枢神经系统中重要的神经递质,具有多种重要生理功能.随着GABA生理功能研究的不断深入,它的应用领域越来越广泛.构建了谷氨酸脱羧酶高表达菌株,通过高密度发酵后提取纯化谷氨酸脱羧酶,以离子液体再生纤维素为载体固定化谷氨酸脱羧酶,催化制备GABA,显著提升了GABA的生产效率,满足医药...     

γ-聚谷氨酸的微生物合成及应用

γ-聚谷氨酸是一种多功能、可降解的生物高分子,可由微生物发酵合成,近年来受到广泛关注。文章综述了γ-聚谷氨酸的化学结构、制备方法(重点是微生物发酵合成法)、产生菌及相应发酵条件、微生物合成γ-聚谷氨酸的分子机制及γ-聚谷氨酸在医药、食品、化妆品、农业、工业等方面的应用,并对γ-聚谷氨酸研究的发展前景作了展望。     

猪肾γ-谷氨酸基转移酶(GGT)的提纯及其稳定性

目的 提纯活性稳定的GGT，制备用于GGT（测定的参考品。方法 用差速离心法从猪肾皮质中分离刷状缘微绒毛膜，用 Triton X－100溶解膜结合的酶，用抗GGT亲和层析柱提纯 GGT，检测提纯品的有关特性。结果 提纯品GGT比活600IU/mg蛋白，得率45.5%，未测出临床常测的酶，在不同方法间的活性比与人血清GGT相似，在特定介质中制成冻干品，经加速变性试验，在-20℃和4℃预期年失活率分别为0．02％和0．25％。结论 本法提纯GGTT速度快，得率高，几乎不含杂酶，稳定性好，在不同方法间与人血清酶有互换性，是用于制备酶参考品提纯GGT的理想方法。