两种来源于牛皮胶原蛋白的新型ACE抑制肽

从牛皮胶原蛋白中鉴定分离出抑制血管紧张素Ⅰ转换酶(ACE)的多肽片段。首先优化牛皮胶原蛋白水解方法,应用胃蛋白酶和碱性蛋白酶获得活性最高的水解产物(抑制ACE的IC50为0.168 mg/m L)。经MW 5000超滤分离后,得到水解液中活性最高的部分(IC50为0.079 mg/m L)。对分离后低于MW 5000的部分经RP-HPLC进一步分离,发现含有大量ACE抑制肽,并应用RP-HPLC-MS/MS鉴定出两种新型ACE抑制肽,氨基酸序列分别为ISVPGPM和LGPVGNPGPA,IC50值分别为0.017 mg/m L(24.3μmol/L)和0.077 mg/m L(87.8μmol/L)。最后,本文模拟了两种抑制肽在体内生理环境下的消化,发现均可被部分降解,且消化产物具有与原始多肽相近的ACE抑制活性。     

鱿鱼下脚料水解物的制备及降血压抑制肽研究

通过对鱿鱼肝脏蛋白水解液中抑制肽的研究,为鱿鱼及其下脚料水解物的高效利用奠定了理论基础。采用酶解技术和凝胶过滤分离等技术进行研究。实验得出:胃蛋白酶为鱿鱼肝脏蛋白水解的最佳酶类,同时以水解度和ACE抑制活性为指标,得出胃蛋白酶水解的最佳条件:在36℃条件下酶解22h,酶与底物的质量比2%,底物浓度2.5%。经过上述条件处理后的水解液经超滤处理(分子量为20ku)后,用Sephadex G-50进行分离,洗脱得到等5个峰值,其中组分B的ACE抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)达到1.80mg/mL。     

深海鲑鱼皮来源ACE抑制肽的分离及鉴定

为了考察海洋胶原低聚肽中ACE抑制肽的活性和结构,本文以深海鲑鱼皮为原料,采用两步酶解法制备出海洋胶原低聚肽,在对其分子量分布进行分析的基础上,测定了其血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性。结果表明,海洋胶原低聚肽中分子量小于1000 u的组分高达90.79%,主要分布在132~576 u范围内,其ACE抑制活性的IC50为1.18±0.12 mg/m L。然后利用反相高效液相色谱(RP-HPLC)对海洋胶原低聚肽进行分离纯化,收集11个组分峰,对其ACE抑制活性进行了测定。结果表明,有7个组分的ACE抑制活性比海洋胶原低聚肽高。最后利用Q-TOF质谱仪对收集的11个组分进行了结构鉴定,并对鉴定出的15个肽段进行了ACE抑制活性测定。结果表明,15个肽段均有一定的ACE抑制活性,其中Ala-Pro(AP)、Val-Arg(VR)、Gly-Arg(GR)的ACE抑制率比海洋胶原低聚肽高,IC50值分别为0.07±0.01 mg/m L、0.35±0.03 mg/m L、0.92±0.85 mg/m L,活性大约是海洋胶原低聚肽的16.86、3.37、1.28倍,是具有较高ACE抑制活性的肽段。     

中国毛虾酶解产物的分子量分布及ACE抑制活性

利用胃蛋白酶酶解中国毛虾制备具有血管紧张素转化酶抑制活性的酶解产物,并采用凝胶色谱法探讨酶解产物的分子量分布。结果表明:在45℃、pH2.5、酶量2%(w/w)、酶解4h、底物浓度20%(w/v)条件下,中国毛虾酶解产物的ACE抑制率高达85.9%;Sephadex G-15葡聚糖凝胶色谱图上出现5个吸收峰,其中高ACE抑制活性组分的分子量在1320～311之间,IC50为0.77mg/mL。     

酶解玉米胚芽粕制备ACE抑制肽的条件优化

采用碱性蛋白酶酶解玉米胚芽粕制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,并以ACE抑制率为指标,在单因素的基础上,通过L9(34)正交试验来确定酶解的最佳工艺条件。最佳酶解条件为:底物浓度5%(w/v)、加酶量3%(w/w)、温度60℃、pH 8.5、水解时间2.5 h,在此条件下,水解物对ACE抑制作用最强,抑制率可以达到86.38%(此时水解度为22.76%)。以截留分子量为6KDa的超滤膜分离该水解物,测定两组分的ACE抑制活性。酶解液经超滤后组分Ⅱ(M6 kDa)的IC50值达到1.38 mg/mL,优于未超滤的酶解液的IC50值(3.16 mg/mL)。     

酶解猪血浆蛋白粉制备ACE抑制肽的工艺优化

选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白酶水解猪血浆蛋白粉,通过单因素和正交试验考察其水解产物对ACE的抑制活性,并优选酶解工艺条件。结果显示:胃蛋白酶适宜水解血浆蛋白粉,制备ACE抑制肽;影响胃蛋白酶水解的4个因素主次顺序为底物质量浓度>酶解时间>pH值>酶与底物质量比(m酶:m底物),其中底物质量浓度和酶解时间的影响显著(P<0.05),pH值和m酶:m底物的影响不显著(P>0.05);适宜胃蛋白酶水解的条件为pH2.3、水解时间1.5h、底物质量浓度1g/100mL、m酶:m底物1:6。     

酶解鸭骨制取ACE抑制肽工艺条件的优化

采用木瓜蛋白酶水解鸭骨制取血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,通过四元二次通用旋转设计优化水解工艺,建立数学模型,分析水解度与ACE抑制率的相关性,并通过不同规格的超滤离心管对酶解产物进行分离.结果表明,木瓜蛋白酶在底物浓度11.5g/100mL,酶底比8000U/g,水解温度60℃,水解时间5.5h,pH值为5.5的条件下,酶解产物的ACE抑制率最高,达到85.71％,水解度为20.81％,且水解度与ACE抑制率显著相关,曲线拟合方程为Y=- 157.572+21.215X-0.491X2.超滤后分子量为2ku～3ku的肽段ACE抑制率最高,达到91.67％,半抑制浓度(IC50)为0.927mg/mL,ACE抑制肽回收率为1.99％.     

酶解水牛乳蛋白制备ACE抑制肽的工艺优化

以水牛乳蛋白为原料,选用6种蛋白酶在各自适宜的条件下酶解制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,用高效液相色谱检测酶解产物对ACE的体外抑制活性,筛选出胃蛋白酶为制备水牛乳蛋白ACE抑制肽的最佳用酶.在此基础上,分别考察了酶解时间、初始酶用量、初始底物浓度、酶解温度和pH值对酶解工艺的影响,得到水牛乳蛋白制备ACE抑制肽的适宜酶解工艺条件:酶解时间为3h,酶用量为10 000U/g,底物质量浓度为20 g/L,反应温度为37℃,pH值为2.0,此时酶解产物的水解度为17.4％,ACE抑制率可达90.0％.采用超滤技术对酶解产物活性组份进行分离富集,结果表明产物中高活性部分均可富集于10 ku和5 ku渗透液中,且高活性组份分子量主要集中在5 ku以下,该组份对ACE的活性抑制率为84.7％.     

猪股骨酶解液中降血压肽的活性及其体外稳定性研究

采用0.22、0.45μm两种孔径滤膜过滤猪股骨酶解液,再利用截留分子量为5、3、2ku的超滤离心管对过滤后的酶解液进行超滤,比较两种滤膜过滤的酶解液超滤分离后的各分子量段滤液的色值、澄清度、蛋白损失率及ACE(血管紧张素转换酶)抑制活性,并将ACE抑制活性最高的分子量段进行模拟胃肠道及耐热、耐酸碱实验。研究显示:0.22μm微孔滤膜处理的酶解液超滤后的色值、澄清度效果好于0.45μm微孔滤膜,两者超滤后各个分子量段的ACE抑制率差异不显著,蛋白回收率前者较低,分子量2ku的滤液活性最高,其IC50值为0.83mg/m L。分子量2ku经胃蛋白酶、胰蛋白酶作用后,ACE抑制活性仍然保持原来的95%以上,该分子量段的滤液有良好的胃肠道耐受性、热稳定性及耐酸碱性。     

双酶水解螺旋藻藻胆蛋白制备ACE抑制肽的工艺优化

以螺旋藻为原料,采用反复冻融和超声波解冻结合法提取藻胆蛋白,利用等电点分离藻胆蛋白,采用SDS-PAGE电泳确定分离蛋白的种类。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶双酶先后水解藻胆蛋白。通过单因素实验和正交实验优化胃蛋白酶和胰蛋白酶水解藻胆蛋白制备血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽的工艺,研究表明:胃蛋白酶水解藻胆蛋白最佳酶解工艺条件是水解温度为37℃,底物质量浓度为6%(w/v),酶与底物比为5220 U/g,此时ACE抑制率为82.07%。胰蛋白酶水解藻胆蛋白最佳酶解条件是温度为42℃,底物质量浓度为6%(w/v),酶与底物比为5220 U/g,此时ACE抑制率为80.35%。利用超滤离心管获得分子量小于3 kDa的藻胆蛋白ACE抑制率94.30%。     

螺旋藻蛋白水解产物对ACE抑制活性的研究

采用胃蛋白酶和胰蛋白酶水解螺旋藻藻胆蛋白制备ACE 抑制肽,通过体外实验测定其ACE 抑制率,以ACE 抑制率为指标确定两种蛋白酶的水解条件。结果表明：胃蛋白酶水解条件为：水解温度37℃,酶与底物比1:50,pH3.0,底物质量分数5%,水解产物的ACE 抑制率为82.16%,其IC50 值为0.104mg/ml;胰蛋白酶水解条件为：水解温度42℃,酶与底物1:50,pH8.0,底物质量分数6%,水解产物的ACE 抑制率为93.54%,其IC50值为0.017mg/ml。此外,胃蛋白酶水解产物再用胰蛋白酶水解,其产物的IC50 值为0.087mg/ml。     

鱿鱼肝脏蛋白水解液及ACE 抑制肽的制备

为高效利用鱿鱼及其下脚料肝脏蛋白水解物,采用酶解技术和凝胶过滤分离等技术对鱿鱼肝脏蛋白水解液中抑制肽进行研究。结果表明：胃蛋白酶为鱿鱼肝脏蛋白水解的最佳酶类,同时以水解度和ACE 抑制活性为指标,得出胃蛋白酶水解的最佳条件：在36℃条件下酶解22h,酶与底物的质量比2%,底物质量分数2.5%。经过上述条件处理的水解液再经超滤处理(截留分子质量为20kD)后,用Sephadex G-50 进行分离,洗脱得到5 个峰,其中组分B 的ACE 抑制活性最高,其半抑制浓度(IC50)达到1.80mg/mL。     

膜法制备血红蛋白血管紧张素Ⅰ转化酶抑制肽

研究了猪血粉酶解及超滤法制备血管紧张素Ⅰ转化酶(ACE)抑制肽的工艺条件。首先将胃蛋白酶的猪血粉水解产物,依次通过30、10 ku和6 ku 3个截留分子质量(MWCO)的超滤膜,获得4组不同分子质量段(P-Ⅰ、P-Ⅱ、P-Ⅲ和P-Ⅳ)的血红蛋白多肽组分,质量浓度为1 mg/m L时,4个组分对ACE的抑制率分别为16.5%、21.7%、24.3%和55.6%。其次对抑制活性较低的3组分,分别用胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行二次酶解,底物浓度均为2.0%,酶与底物质量比1.0%,根据ACE抑制率,分别确定各组分的二次酶解条件,结果显示P-Ⅰ、P-Ⅱ使用碱性蛋白酶酶解1 h时活性最强,P-Ⅲ使用中性蛋白酶酶解5 h时活性最强,得出结论血红蛋白二次酶解使水解产物的活性增强,且蛋白酶水解与膜分离的工艺适合于工业化生产。     

基于旋转设计优化胶原蛋白ACE抑制肽 制备工艺

采用Protamex~蛋白酶水解鱼胶原蛋白源制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,并采用p H-stat法测定水解度,对影响水解效果的p H值、温度、底物浓度和加酶量4个因素进行考察,并进行三元二次通用旋转设计进行优化,对活性肽的ACE抑制活性和结构进行分析。结果表明在底物浓度11.8%,p H 8.7,加酶量5.4%和酶解温度53.6℃条件下,酶解1 h所得的鱼皮胶原蛋白水解度为16.6%,经高效液相测定鱼皮ACE抑制活性为45%,经圆二色谱分析鱼胶原蛋白ACE抑制肽主要以无规卷曲形式存在。     

猪皮胶原ACE抑制肽的纯化与鉴定

采用超声协同稀碱对猪皮实施预处理后,酶解30 min制得的高血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性水解液为原料,采用Sephadex G-15、半制备高效液相色谱分离纯化其中胶原ACE抑制肽并对其序列进行鉴定。结果表明,Sephadex G-15分离胶原ACE抑制肽的最佳分离条件为:样品浓度100 mg/m L;上样量2 m L;流速2 m L/min;洗脱剂为蒸馏水;层析柱为1 m×10 mm的层析柱。在该分离条件下,混合肽被分成AP-I、AP-II两个组分,IC50值分别为19.50、1.01 mg/m L。对抑制活性较强的AP-II进一步采用半制备高效液相色谱进行分离,得到8个组分峰,其中峰2、峰5和峰6的IC50值最小,分别为0.73、0.44和0.4 mg/m L。结合IC50值的大小及半制备收集到样品的量,对峰2和峰6采用LC-MS/MS进行序列分析。结果显示峰2的多肽序列为QGPPGPAGPR(P为Hyp),峰6的序列为AGPPGPPGPA,这两个序列位于胶原蛋白α1链中526?535、730?739位。     

木瓜蛋白酶制备广昌白莲降血压活性肽的研究

为探讨木瓜蛋白酶对广昌白莲蛋白的水解特性及所获多肽的降血压活性,以广昌白莲蛋白为原料,以水解度(hydrolysisdegree,DH)为指标,选用木瓜蛋白酶水解白莲蛋白获得多肽,通过测定多肽对血管紧张素转换酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的抑制活性,得到广昌白莲ACE抑制活性肽.通过正交实验Ln(34)因素水平实验法确定木瓜蛋白酶水解白莲的最优条件为pH6.5,温度55℃,底物浓度5％,酶浓度8％.由极差值R可知各因素的主次关系是温度＞pH＞底物浓度＞酶浓度.对不同水解度下的多肽进行了降血压活性的研究,结果表明,ACE抑制率与水解度呈正相关.对多肽进行大孔吸附树脂静态乙醇分级洗脱后测定降血压活性,结果表明,经25％乙醇洗脱后,多肽降血压活性最高,为55.78％,其IC50为0.045mg/mL.     

条斑紫菜蛋白酶解物降血压活性

研究了以条斑紫菜为原料,采用木瓜蛋白酶制备紫菜蛋白活性寡肽,以ACE抑制率为评价指标,研究不同水解条件下酶解液的降血压活性,优化酶解工艺条件并测定酶解物的分子量。优化后的木瓜蛋白酶酶解工艺条件为pH7.5,温度50℃,底物浓度30 mg/mL,酶添加量600 U/g,在此条件下,水解4 h的酶解产物抑制活性达30%以上,ACE抑制肽的半抑制浓度IC50值为4.48 mg/mL。将制备的酶解液进行层析分析,测得具有降血压活性的紫菜蛋白酶解产物是相对分子质量小于2 000的活性肽。     

碱性蛋白酶酶解魔芋飞粉制备ACE抑制肽研究

以水解度为指标,对碱性蛋白酶酶解魔芋飞粉蛋白条件进行优化;测定不同酶解阶段及不同分子质量魔芋多肽的ACE抑制活性,筛选具有高ACE抑制活性的降血压多肽。结果表明:在底物质量分数2.25%,加酶量3 500 U/(g底物),温度55℃,pH 7.82的条件下酶解270 min,酶解产物的ACE抑制率达到最大值94.6%,此时水解度9.97%,多肽得率12.26%;酶解液经浓缩、干燥得到的魔芋多肽粉呈淡黄色,多肽含量52.62%,粗蛋白含量62.30%;用葡聚糖凝胶G-25和葡聚糖凝胶G-15串联柱分离得到2个具有高ACE抑制活性的多肽组分,其分子质量分别为1 500和1 000 Da,半抑制质量浓度分别为0.12 mg/mL和0.088 mg/mL。     

大米蛋白酶解物的ACE抑制活性研究

为了考察大米四种蛋白经模拟体外消化后能否产生ACE抑制活性肽及其活性状况,本研究以大米为原料,Osborne法提取大米四种蛋白。体外模拟胃肠道消化过程,研究消化酶解ACE抑制活性肽产生情况及其活性大小,同时检测酶解产物的水解度和分子量分布。实验结果表明,大米四种蛋白经胃蛋白酶消化30min,酶解产物的ACE抑制活性均达到较高水平,随后经过胰蛋白酶作用,酶解产物的ACE抑制活性下降。大米清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的4h消化产物半抑制浓度IC50值分别为1.45mg/mL、0.91mg/mL、1.19mg/mL和0.75mg/mL,分子量集中在1000u以下,是易于被人体吸收的ACE抑制活性肽。同时,未经酶解的蛋白几乎没有ACE抑制活性。结果说明大米四种蛋白的体外消化酶解物具有不同大小的ACE抑制活性,其中大米谷蛋白消化产物的ACE抑制活性最高,人体正常食用大米蛋白,经胃肠消化可以产生被人体吸收的ACE抑制活性肽。     

鱼鳞明胶ACE抑制肽的制备及其活性研究

利用Alcalase 2.4L酶解鱼鳞明胶制备具有血管紧张素转化酶(ACE)抑制活性的降血压肽,通过超滤处理富集得到具有较高活性的ACE抑制肽,并对该组分进行分子量分布、氨基酸组成分析及抗消化性研究。结果表明:水解明胶6 h所得水解物的ACE抑制活性最高,其IC50为0.56 mg/mL,水解度为15.54%;超滤膜处理分离后,分子量小于5 kDa的多肽组分Ⅱ的ACE抑制活性最高,其回收率达90%以上;多肽中对ACE抑制活性贡献大的脯氨酸、羟脯氨酸、色氨酸等疏水性氨基酸的保存率高;体外消化实验显示,该抑制肽在胃肠道消化酶作用下能保持较好的ACE抑制活性。