基于基因转录和代谢物分析的异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌YILW的理性改造

为获得异亮氨酸生产菌谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）YILW的理性改造策略,考察该菌株与出发菌株C. glutamicum ATCC 13032异亮氨酸合成途径中关键酶及代谢产物的差异。结果表明,C. glutamicumYILW丙酮酸羧化酶编码基因pyc的下调表达使得其胞内草酰乙酸含量降低,过表达该基因显著增加胞内草酰乙酸含量及异亮氨酸产量（分别从1.32 μmol/g（细胞干质量,下同）和5.18 g/L提高至3.32 μmol/g和5.81 g/L）,但副产物赖氨酸及胞内2-酮丁酸积累量提高。针对该问题采用强启动子替换手段过表达ilvBNC操纵子,使得其异亮氨酸产量提高至6.63 g/L。为进一步增加异亮氨酸合成,过表达输出载体编码基因brnE和brnF,其产量提高至7.31 g/L,较出发菌株C. glutamicum YILW提高41.1%,转化率提高40.0%。由此可见,在基因转录及代谢物分析结果指导下理性过表达pyc、ilvBNC操纵子及brnE和brnF能够显著提高异亮氨酸产量并降低副产物浓度。     

增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成L-异亮氨酸的影响（英文）

该实验考察和比较增强回补途径对谷氨酸棒状杆菌合成Lacterium glutamicum-异亮氨酸的影响。通过以L-异亮氨酸生产菌Corynebppc YI为出发菌株,分别采用基因组整合和质粒的方式过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因及丙酮酸羧化酶编码基因pyc。结果表明,获得pyc基因组整合和质粒过表达菌株ILE01和ILE02,摇瓶条件下菌株L-异亮氨酸产量分别提高17. 3%(6. 1 g/L)和9. 6%(5. 7 g/L)、发酵罐条件下分别提高11. L7%(24. 8 g/L)和8. 1%(24. 0 g/L)。获得ppc基因组整合和质粒过表达菌株ILE03和ILE04,摇瓶条件下菌株-异亮氨酸产量分别提高(30. 8%(6. 8 g/L)和13. 5%(5. 9 g/L)、发酵罐条件下分别提高15. 8%(25. 7 g/L)和9. 5%24. 3 g/L)。此外,过表达pyc和ppc还可不同程度地提高L-异亮氨酸转化率。然而采用质粒过表达pyc和ppc均使得菌株生物量下降。因此,过表达pyc和ppc均能显著提高L-异亮氨酸产量和转化率,基因组整合的过表达方式效果优于质粒...     

ilvBNC操纵子协同cimA基因过表达提高Corynebacterium glutamicum YILW L-异亮氨酸产量的研究

L-异亮氨酸是人和动物八种必需氨基酸之一,在生命活动中具有重要地位。乙酰羟基酸合成酶(acetohydroxyacid synthase,AHAS)是L-异亮氨酸合成途径的关键酶(由ilvBN编码),α-酮基丁酸是L-异亮氨酸合成的重要前体。因此强化ilvBN的表达以及增加α-酮基丁酸的供应理论上可提高L-异亮氨酸的合成。cim A编码的甲基苹果酸合成酶可以催化丙酮酸和乙酰-Co A快速生成L-异亮氨酸前体α-酮基丁酸,从而增强主代谢流通量。本文采用基因重组手段将L-异亮氨酸生产菌株Corynebacterium glutamicum YILW ilvBNC操纵子中的启动子替换为强启动子Ptac获得C.glutamicum YILWPtac。摇瓶发酵结果显示该菌株L-异亮氨酸产量和转化率分别较出发菌株提高了14.8%和18.6%。在此基础上过表达cimA基因,获得C.glutamicum YILWPtacp XMJ19cim A,其L-异亮氨酸酸产量和糖酸转化率分别较出发菌株提高了14.5%和42.4%。本研究可为氨基酸生产菌株的选育提供依据。     

全局调控因子Lrp的表达强化谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸

作者研究发现全局调控因子Lrp的表达能促进谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-缬氨酸,但对菌体生长有一定影响。RT-PCR分析发现:Lrp的表达能提高L-缬氨酸合成相关基因ilv A、ilv BN、ilv C、ilv D及转运相关基因brn FE的转录水平,这也许是L-缬氨酸产量提高的原因。实验还发现:表达含有点突变(Arg39Trp)的Lrp可以进一步提高谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸的产量,而且对菌体生长的影响也减小;这种效果在lrp-brn F间隔区域存在突变的L-缬氨酸生产菌VWB-1中更加明显。在VWB-1中共表达lrp1和brn FE基因,5 L罐发酵L-缬氨酸产量达到42.1 g/L,比对照提高了48.9%。     

代谢工程改造大肠杆菌合成L-异亮氨酸的研究

以L-苏氨酸生产菌Escherichia coli THRD为出发菌株,利用基因重组技术替换ilvLXGMEDA启动子并过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,以期获得L-异亮氨酸生产菌.将ilvLXGMEDA启动子替换为强启动子Ptrc并敲除ilvLXGM后获得ILE01菌株,于该菌株中分别过表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvIH及共表达解除L-异亮氨酸反馈抑制的ilvA和ilvIH,获得菌株ILE02和ILE03,其L-异亮氨酸产量分别达到1.75 g/L和2.19g/L.针对ILE03 α-酮丁酸积累量过高的问题,通过改变操纵子中ilvA和ilvIH的顺序调节其转录水平,获得菌株ILE04,其L-异亮氨酸产量达2.85 g/L.利用ILE04于5L发酵罐中进行发酵实验,L-异亮氨酸产量、发酵强度及转化率分别为5.23 g/L、0.17 g/(L·h)及4.6％.     

基于代谢途径改造谷氨酸棒杆菌生产L-缬氨酸

L-缬氨酸是一种重要的支链氨基酸，随着市场对其需求量的不断提升，进一步提高L-缬氨酸的产量和糖酸转化率具有重要意义。在该研究中，使用实验室保藏的谷氨酸棒杆菌VHL-1作为出发菌株，通过对L-缬氨酸合成路径进行代谢改造显著提高了L-缬氨酸的产量和丙酮酸前体物的供应。首先，通过敲除ldh(编码乳酸脱氢酶)、poxB(编码丙酮酸氧化酶)、pyc(编码丙酮酸羧化酶)基因以及弱化alaT(编码丙氨酸转氨酶)基因表达来实现丙酮酸的富集。其次，通过强启动子P_tuf替换ilvBNC操纵子原始启动子并增加ilvBN(编码乙酰羟酸合酶)基因拷贝数来增强丙酮酸向L-缬氨酸合成的碳代谢流。最后，通过过表达支链氨基酸转运蛋白编码基因brnFE和调节蛋白编码基因lrp增强L-缬氨酸胞外输出效率。最终构建的重组菌株VHL-9在5 L生物反应器中进行补料分批培养，L-缬氨酸产量可到达(82.5±5.6) g/L,生产强度为1.15 g/(L·h),糖酸转化率为0.302 g/g葡萄糖。     

高产L-精氨酸谷氨酸棒状杆菌的构建

以产L-精氨酸诱变菌株谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）AJC为出发菌株,采用基因组编辑技术对其进行改造。 首先,敲除阻遏蛋白ArgR和FarR,解除反馈阻遏作用;然后,敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh和整合鸟氨酸乙酰转移酶编码基因argJ,阻 断乳酸合成途径和增加前体物;最后,敲除谷氨酸分泌蛋白编码基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶基因argB,减弱L-谷氨酸的胞 外分泌,筛选一株L-精氨酸高产菌株。 结果表明,获得一株高产L-精氨酸菌株AJC-4（C. glutamicum AJCΔargRΔfarRΔldh::PtufargJ ΔNCgl1221::PsodargB）,该菌株在5 L发酵罐中发酵64 h后,L-精氨酸产量和糖酸转化率分别为78.0 g/L和0.38 g/g,较出发菌株AJC分 别提高21.9%、18.8%;副产物乳酸和L-谷氨酸积累量分别为0.11g/L、0.16 g/L,较出发菌株AJC分别降低96.8%、96.1%。     

L-2-氨基丁酸大肠杆菌生产菌株的构建

L-2-氨基丁酸作为新型药物的关键手性前体,在化工和制药行业应用广泛。该文以1株生产L-苏氨酸的大肠杆菌(Escherichia coli) THRD为出发菌株,逐步延伸代谢途径,构建了L-2-氨基丁酸高产菌株。首先,分别把苏氨酸脱水酶编码基因ilv A2和ilv A4在THRD中过表达,菌株THRD/p Trc99a-ilv A2在5 L发酵罐中分批补料发酵,2-酮基丁酸积累量达到18 g/L。然后,分别与ilv A2串联表达酪氨酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶编码基因tyr B、gdh和bcdBS,将L-2-酮基丁酸转化为L-2-氨基丁酸,菌株THRD/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量达到19 g/L。最后,研究了阻断L-苏氨酸输出途径对发酵的影响,菌株THRDΔrht C/p Trc99a-bcdBS-ilv A2的L-2-氨基丁酸产量提升至22 g/L。因此,通过代谢途径延伸可以有效地将L-苏氨酸生产菌株转变为L-2-氨基丁酸生产菌株。该研究为L-2-氨基丁酸高产菌株的构建奠定了基础,且对其他延伸代谢途径获得新产品的代谢工程研究提供了参考。     

组成型过表达ido基因对4-羟基异亮氨酸合成的影响及其发酵培养基的响应面优化

为考察组成型过表达异亮氨酸羟化酶（isoleucine dioxygenase,IDO）基因ido对4-羟基异亮氨酸合成的影响,构建ido组成型表达质粒pXM01-ido及菌株HIL017,其ido转录量及IDO活性较诱导型过表达菌株HIL016显著提升,4-羟基异亮氨酸产量较HIL016提高19.4%。为进一步提高4-羟基异亮氨酸产量,通过Plackett-Burman试验确定HIL017发酵培养基中玉米浆、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量为主要影响因素,利用最陡爬坡试验和响应面法确定其最优用量为玉米浆34.1 mL/L、谷氨酸2.98 g/L、FeSO4·7H2O 0.016 7 g/L,此时4-羟基异亮氨酸理论产量为5.57 g/L。验证实验结果表明,最佳条件下4-羟基异亮氨酸产量为5.53 g/L,较优化前提高19.7%。     

代谢工程改造谷氨酸棒杆菌合成四氢嘧啶

为了获得四氢嘧啶生产菌株并利用此菌株提高四氢嘧啶产量,以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）野生菌株ATCC13032为研究对象,以赖氨酸积累量为评价指标,强化了天冬氨酸-β-半醛合成代谢流;通过阻断赖氨酸输出通道LysE,表达不同来源的四氢嘧啶操纵子ectABC,获得了四氢嘧啶生产菌株;通过强化天冬氨酸转氨酶和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）再生途径,进一步提高四氢嘧啶产量。结果表明,构建了一株高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株LYS-3,赖氨酸积累量为28.48 g/L;表达操纵子HEectABC的谷氨酸棒杆菌ECT-3四氢嘧啶产量达到17.21 g/L;过表达基因aspC和ECpntAB谷氨酸棒杆菌ECT-6,摇瓶发酵四氢嘧啶产量达到21.85 g/L。研究结果可为天冬氨酸-β-半醛衍生物的生物合成提供参考。     

NCgl1221敲除和pyc过表达对谷氨酰胺发酵的影响

谷氨酰胺在生命活动中具有重要的作用,已被广泛应用于食品、医药等诸多领域。谷氨酸是谷氨酰胺生物合成的前体物质,也是谷氨酰胺生产过程中最常见的副产物。研究发现,NCgl1221基因的编码蛋白是谷氨酸分泌的重要载体,丙酮酸羧化酶是谷氨酸棒杆菌回补途径中的关键酶。为减少谷氨酰胺发酵过程中谷氨酸的积累量并提高谷氨酰胺产量,本研究利用同源重组技术敲除谷氨酰胺生产菌GM34的谷氨酸分泌载体编码基因NCgl1221,获得GM34ΔNCgl1221菌株;构建了丙酮酸羧化酶基因pyc过表达菌株GM34-pXMJ19pyc。5 L罐发酵实验表明,NCgl1221基因缺失可以使得谷氨酸积累量降低19.05%,过表达pyc基因使得谷氨酰胺产量和转化率分别提高5.54%和2.37%。可见,敲除NCgl1221、过表达pyc能够有效降低谷氨酸分泌并提高谷氨酰胺产量。     

L-亮氨酸生物合成关键酶基因的克隆和表达

通过PCR获得黄色短杆菌ATCC14067基因组上编码L-亮氨酸合成途径中关键酶的基因.连接大肠杆菌-谷氨酸棒状杆菌穿梭表达质粒pDXW-8构建多种重组质粒,分别转化模式菌株C.glutamicum ATCC13032考察对其发酵生产L-亮氨酸的影响.经摇瓶发酵实验显示:C.glutamicum ATCC13032发酵液中没有L-亮氨酸的积累而基因工程菌ATCC13032/pDXW-8-leuA-ilvBNC中L-亮氨酸的产量达4.75g/L.     

不同葡萄糖转运途径相关基因的过表达对菌株葡萄糖代谢及产物合成的影响

磷酸烯醇式丙酮酸-葡萄糖磷酸转移酶系统(phosphoenolpyruvate-dependent glucose phosphotransferase system,PTS~(Glc))和不依赖于PTS~(Glc)系统葡萄糖转运系统在葡萄糖转运和磷酸化过程中起重要作用。该文通过在葡萄糖代谢缓慢的L-赖氨酸产生菌Corynebacterium glutamicum(C.glutamicum)ZL-8中过表达肌醇透性酶基因(iol T1)、葡萄糖激酶基因(ppgk)和EIIGlc基因(pts G),研究葡萄糖转运途径相关基因对葡萄糖代谢速率、L-赖氨酸及副产物合成的影响。与出发菌株C.glutamicum ZL-8相比,重组菌C.glutamicum ZL-8/p ECXK-99E-ppgkiol T1(葡萄糖激酶酶活力提高了768%)和C.glutamicum ZL-8/p DXW-8-pts G(PTS~(Glc)系统酶活力提高了62.7%)葡萄糖消耗速率分别提高了16.7%和27.3%,L-赖氨酸产量分别提高了24.7%和16.4%。此外,有机酸和氨基酸分析结果表明,过表达不同葡萄糖转运途径基因对有机酸(丙酮酸、乳酸和乙酸)和副产物氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、天冬氨酸)具有不同的影响。     

转运系统集成改造提升大肠杆菌胞外蛋氨酸积累

通过构建大肠杆菌(Escherichia coli)W3110 MetD吸收系统编码基因metI、metN、metQ单个缺损菌株,获得胞外蛋氨酸吸收速率最小菌株;游离及染色体整合表达YjeH和YeaS分泌系统编码基因yjeH和yeaS,研究增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对菌体胞外蛋氨酸积累和生物量的影响,为理性构建蛋氨酸高产菌株提供可行策略。实验结果表明,基因metI的缺损对胞外蛋氨酸的吸收影响最大,吸收速率降低了16.7%;游离表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸开始积累,胞外蛋氨酸最大积累量为0.21 g/L和0.18 g/L;染色体整合表达基因yjeH和yeaS,胞外蛋氨酸的最大积累量为0.48 g/L和0.25 g/L,与游离表达相比提高了128%和38.9%。增强蛋氨酸分泌与弱化蛋氨酸吸收集成改造策略对于促进胞外蛋氨酸的积累效果显著,可以作为理性构建蛋氨酸高产菌株的策略。     

代谢工程构建谷氨酸棒杆菌合成5-氨基乙酰丙酸

非蛋白氨基酸5-氨基乙酰丙酸是合成四氢吡咯化合物的前体物,被广泛应用于医药、农业和畜牧业。为提升5-氨基乙酰丙酸合成效率,该研究以谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032为出发菌株,首先敲除L-谷氨酸输出蛋白编码基因NCgl1221阻断其分泌,菌株5-氨基乙酰丙酸产量达到0.62 g/L。然后利用脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)脚手架体系组装关键酶谷氨酰-tRNA还原酶和谷氨酸-1-半醛氨基转移酶,当二者比例为2∶1时最有利于5-氨基乙酰丙酸的合成,产量为0.84 g/L;为增强三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环,分别通过过表达pyc、ppc和pckA强化回补途径,结合过表达gltA强化柠檬酸合成,结果表明以共表达pckA和gltA的效果最佳;在此基础上通过敲除aceA并过表达pntAB以增强α-酮戊二酸和NADPH供应,所获菌株ALA-10的5-氨基乙酰丙酸产量为1.47 g/L。该研究可为提升5-氨基乙酰丙酸的发酵合成效率提供参考。     

调控NADH/NAD~+对重组谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌中,L-丝氨酸由糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸经过3步反应生成,这个过程产生2个NADH,而L-丝氨酸的合成过程并不涉及NAD~+的生成,多余的NADH是否会影响菌株的生长及产L-丝氨酸?该研究通过外源添加NAD~+的前体物质烟酸,内源表达NADH氧化酶编码基因nox A,考察调控NADH/NAD~+对Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI生长和产L-丝氨酸的影响。结果表明,添加不同浓度烟酸,菌株的L-丝氨酸产量、生物量及糖耗较未添加时略有提高。而通过加强表达NADH氧化酶编码基因nox A,构建重组菌Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI-nox A,重组菌中NADH氧化酶比酶活是出发菌的11.6倍,L-丝氨酸产量达到28.93 g/L,较出发菌提高9.0%,糖酸转化率达到0.29 g/g蔗糖,较出发菌提高7.4%,OD562最大值为51.38,较出发菌提高6.6%,说明NADH氧化酶的过表达能够促进重组菌株的生长及碳源利用,提高菌株的L-丝氨酸产量。     

代谢工程改造Corynebacterium glutamicum生产L-苹果酸

以提高L-苹果酸的产量为目标,采用一次交换两次同源重组的方法,利用反向筛选标记,在敲除了丙酮酸醌氧化还原酶编码基因(pqo),丙酮酸脱氢酶编码基因(pdh)和乳酸脱氢酶编码基因(lldh)的C.glutamicumΔpqoΔpdhΔlldh(C.glutamicumΔPPL)基础上,无痕敲除了L-苹果酸积累支流代谢途径的2个关键酶基因:苹果酸醌氧化还原酶编码基因(mqo)和苹果酸酶编码基因(male),同时敲入了苹果酸分泌转运蛋白基因(transb),获得了产L-苹果酸的工程菌株;采用高效液相色谱法检测了工程菌株C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale的发酵产物。实验结果表明:C.glutamicum ATCC 13032发酵后不积累L-苹果酸,而工程菌C.glutamicumΔPPLΔmqo::transbΔmale发酵48 h,积累了12.8 g/L的L-苹果酸,工程菌的糖酸转化率为33.18%,为利用C.glutamicum ATCC 13032发酵生产L-苹果酸提供了基础遗传资源。     

大肠杆菌生产莽草酸的基因工程菌构建

莽草酸是芳香族氨基酸合成中的重要中间代谢物,可用于多种药物的化学合成.在代谢工程理论的指导下,构建积累莽草酸的高产菌株.通过构建敲除编码莽草酸激酶的基因aroL与aroK的菌株阻断莽草酸的代谢;通过构建敲除编码奎尼酸/莽草酸脱氢酶的基因ydiB的菌株减少副产物的合成;同时通过构建人工操纵子过表达编码DAHP合酶、莽草酸脱氢酶、脱氢奎尼酸脱水酶和三脱氢奎尼酸合酶的基因aroG,aroE,aroD和aroB以强化莽草酸合成途径.最终得到E.coliSHIK△aroL△ydiB菌株,摇瓶发酵能够积累莽草酸5.5 g/L.     

3-磷酸甘油醛脱氢酶促进谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸

在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum) SNK118中表达NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因,提高胞内NADPH水平,以提高L-精氨酸(L-Arginine)和L-鸟氨酸(L-Ornithine)发酵产量。通过NCBI数据库检索,选取了3个不同来源的3-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因。经测定酶活力,最终选择糖丁基梭菌(Clostridium saccharobutylicum) DSM 13864来源的NADP~+依赖型的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(Csgap C)。构建了产L-精氨酸的重组菌SNK118/p XMJ19-Csgap C,当摇瓶发酵70 h时产L-精氨酸11. 55 g/L,糖酸转化率0. 13 g/g,与对照菌SNK118/p XMJ19相比,精氨酸产量和糖酸转化率分别提高了26%和10. 2%。在L-鸟氨酸生产菌株SNK118Δarg FΔargR中重组表达Csgap C,重组菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19-Csgap C摇瓶发酵70 h产L-鸟氨酸27. 76 g/L,糖酸转化率0. 274 g/g,与对照菌SNK118Δarg FΔargR/p XMJ19相比,L-鸟氨酸产量和糖酸转化率分别提高了20. 1%和15. 6%。结果表明,异源表达Csgap C有助于提高谷氨酸棒杆菌发酵生产L-精氨酸和L-鸟氨酸的水平。     

动态调控谷氨酸棒状杆菌合成4-羟基异亮氨酸

4-羟基异亮氨酸(4-hydroxyisoleucine, 4-HIL)在治疗Ⅱ型糖尿病方面极具潜力。异亮氨酸双加氧酶(isoleucine dioxygenase, IDO)能够将L-异亮氨酸(L-isoleucine, Ile)转变成4-HIL。为提高重组谷氨酸棒杆菌的4-HIL产量同时降低副产物L-赖氨酸(L-lysine, Lys)的合成,首先将Lys-OFF核糖体开关整合到Lys合成途径的关键基因dapA序列上游,得到D-RS菌株。该菌株能够根据胞内外Lys的浓度,动态弱化Lys合成,使Lys的含量降低了46.7%。其次,在该菌株中再利用Ile激活型传感器Lrp-P_brnFEN去控制密码子优化后的ido基因的表达,使4-HIL的产量提高至116.3 mmol/L。最后,为了进一步提高4-HIL产量,利用强启动子P_brnFE7动态控制odhI和vgb的表达,增强α-酮戊二酸和O₂的供应。最终得到了1株摇瓶发酵4-HIL产量高达166.0 mmol/L,Lys含量降至6.5 mmol/L的重组菌株D-RS-