软枣猕猴桃多聚半乳糖醛酸酶提取条件的优化

以软枣猕猴桃为实验材料,确定多聚半乳糖醛酸酶最优提取条件和最适活性分析条件。在提取过程中,以酶比活力为指标确定缓冲液的最适pH值、离子浓度、DTT添加量对PG提取效果的影响,通过正交试验确定最佳提取条件。结果表明：最优提取条件为pH5.5、0.05mol/L 乙酸缓冲液为提取液,加入0.1mol/L NaCl、1mmol/L DTT;最适活性分析条件为反应温度40℃、反应时间90min。     

鲜枣脂氧合酶酶学特性及热失活动力学研究

以亚油酸为底物,采用紫外分光光度法测定鲜枣脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的酶学特性及热失活动力学性质。考察了温度、p H、金属离子及络合物对LOX活性的影响,并建立了LOX酶促反应动力学及热失活动力学参数。结果表明:鲜枣LOX的最大吸收波长为265 nm;最适温度和p H分别为40℃、7.0;在p H值为5.0~6.0的环境中,LOX活性保持相对稳定;酶促反应动力学符合米氏方程所描述的单底物酶促反应动力学,其Km和Vmax分别为0.14 mmol/L、0.26 U/min,鲜枣LOX与底物亚油酸的亲和力较好;且LOX的热失活遵循一级反应动力学规律,反应活化能为105.20 k J/mol;2 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Cu2+、Ca2+、Mn2+对LOX酶活力有激活作用(P0.05),而2 mmol/L Mn2+、Zn2+、Mg2+和10 mmol/L Mg2+,EDTA对LOX活性具有抑制作用(P0.05)。该试验为鲜枣加工贮藏中LOX活性控制提供了有益的数据参考。     

甘蔗汁多酚氧化酶的提取研究

以磷酸盐缓冲液匀浆浸提法提取混合甘蔗汁多酚氧化酶(PPO),探讨缓冲液p H值、表面活性剂添加量和聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)添加量对甘蔗汁PPO提取效果的影响。结果表明,以邻苯二酚为底物时,获得甘蔗汁PPO的酶活性最适测定波长是230 nm。磷酸盐缓冲液提取甘蔗汁PPO最适p H值为6.2;在磷酸盐缓冲溶液中PVPP最适添加量为2%,提取甘蔗汁PPO的比活性最高。在缓冲液中加入表面活性剂Tween 80和Triton X-100时,提取甘蔗汁PPO的比活性较低。     

离子交换层析法分离猪股骨降血压肽的研究

猪股骨酶解液经超滤、凝胶层析初步分离后,为了得到高活性且纯度较高的降血压肽,采用离子交换层析对凝胶层析分离后的高活性组分进一步分离。通过对洗脱液p H、离子强度、流速三个因素进行研究,确定了最佳分离条件:以p H=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液为A液、B液为含1mol/LNa Cl的p H=6.0、0.05mol/L磷酸盐缓冲液,洗脱流速为0.8m L/min。结果显示:离子交换层析分离得3个组分,其中组分1的活性最高,其IC50值为0.1012mg/m L;再利用凝胶层析将组分1进行脱盐,其峰2的IC50值达到0.0836mg/m L,脱盐率达到86.60%±0.5%。     

莴笋多酚氧化酶、过氧化物酶的特性及抑制作用研究

采用分光光度法测定莴笋多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的活性,研究酶的稳定性、温度、p H、底物浓度及几种抑制剂对其活性的影响,建立相应酶促动力学方程,利用正交实验探讨最佳抑制条件。结果表明,PPO和POD最适温度分别为50℃和40℃,最适p H分别为6.0和6.5,随温度不断升高,PPO和POD活性逐渐下降。动力学方程分别为V=342.566[S]/(5.9×10-3+[S])和V=3403.008[S]/(6.88×10-4+[S])。对PPO抑制强弱为:VCL-CysNa HSO3柠檬酸EDTA苯甲酸琥珀酸,对POD抑制强弱为:EDTAVCL-Cys柠檬酸Na HSO3琥珀酸苯甲酸。正交实验表明,对PPO最佳抑制条件为:Na HSO39mmol/L、L-Cys 5mmol/L及VC5mmol/L。对POD最佳抑制条件为:VC0.2mmol/L、EDTA 0.2mmol/L及L-Cys 1.4mmol/L。     

鲫鱼乙酰胆碱酯酶性质及对有机磷农药的敏感性研究

以鲫鱼为原料,分别提取鱼脑、肌肉和肝脏乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,ACh E),研究其酶学性质及对有机磷农药的敏感性。结果表明,鲫鱼脑ACh E最适反应温度为30℃,最适p H为8.0,米氏常数(Michaelis constant,Km)为0.548 mmol/L;鲫鱼肌肉ACh E最适反应温度为35℃,最适p H为7.5,Km为1.75 mmol/L;鲫鱼肝脏ACh E最适反应温度为30℃,最适p H为8.0,Km为0.406 mmol/L。敌敌畏对鱼脑、肌肉和肝脏ACh E的半数抑制质量浓度(50%inhibition concentration,IC50)分别为1.70,3.55和4.52μg/m L,双分子速率常数(bimolecular rate constant,Ki)分别为7.40、7.21、5.94 L/mg·min;辛硫磷对鱼脑、肌肉和肝脏ACh E的IC50分别为2.45,4.05和9.46μg/m L,Ki分别为10.54,10.11和8.32 L/mg·min;毒死蜱对鱼脑、肌肉和肝脏ACh E的IC50分别为10.89、14.33和17.00μg/m L,Ki分别为7.81,6.85和4.99 L/mg·min。鲫鱼脑ACh E对常用有机磷农药表现出了较强的敏感性,可作为环境中有机磷农药残留监测的指示酶。     

超声波、超高压对白鲢鱼肌肉脂肪氧合酶构象及酶活力的影响

本研究采用超声波、超高压对白鲢鱼肌肉中的脂肪氧合酶（lipoxygenase,LOX）进行处理,通过测定 LOX活力、圆二色谱、荧光光谱变化,考察超声波、超高压处理对白鲢鱼肌肉LOX构象及活力的影响。实验结 果表明：随着超声波功率的增加、超声时间的延长,LOX分子内α-螺旋和β-折叠含量降低,荧光强度不断增强, 说明其二级结构和三级结构明显发生变化,使LOX活力不断降低,最适超声条件为300 W、3 h,此时酶活力降低 66.07%;随着超高压压力的增加、超高压时间的延长,LOX分子内α-螺旋和β-折叠含量降低,荧光强度不断减弱, 说明LOX分子二级结构和三级结构发生显著变化,LOX活力迅速降低,最适超高压条件为300 MPa、20 min,此时 酶活力降低93.10%。     

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量的条件优化

以红星苹果果肉为试材,探讨不同提取缓冲液(磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液和水)、缓冲液pH值、浓度、外源添加物和料液比等因素对苹果果肉可溶性蛋白提取效率的影响。结果表明:外源添加PVP和EDTA以及料液比是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1%PVP)、料液比1:25,此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为0.544%,为水提组(0.073%)的7.45倍。     

韭菜β-木糖苷酶的分离纯化与部分性质研究

新鲜韭菜经匀浆、缓冲液提取、硫酸铵分级沉淀、羧甲基离子交换层析(carboxymethyl-sephar ose,CMSepharose)再通过Su perdex-200凝胶过滤层析,从而获得电泳纯的β-木糖苷酶。该酶的比活力达到18.25 U/mg,纯化倍数为12.59,回收率为1.83%,分子质量为123.02 k D,亚基分子质量为61.51 k D。通过对β-木糖苷酶的酶学性质研究得到最适温度为65℃,最适p H值为4。该酶在25~55℃及p H 3.0~5.0的范围内有较好的稳定性;在最适条件下测得其米氏常数(K_m)值为0.28 mmol/L;甲醇、乙醇、异丙醇及十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)和Ag+对该酶具有抑制作用,Mn~(2+)和Co~(2+)对该酶具有一定的激活作用。     

中国蛤蜊内源酶性质的研究

研究了中国蛤蜊的肌肉与消化腺中内源酶的性质。结果表明:1中国蛤蜊肌肉中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H为7.0与9.0,可能存在同工酶;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Ca2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Cu2+在5mmol/L时,对酶活力有激活作用,随着浓度升高对酶活力有抑制作用;Mn2+在5~15 mmol/L时,对酶活力影响不大,在20 mmol/L时对酶活力有激活作用。2消化腺中蛋白酶最适温度为60℃,最适p H 8.0;Pb2+对蛋白酶活力有激活作用;Mn2+对酶活力有抑制作用;Mg2+与Ca2+在5 mmol/L时,对酶活力有抑制作用,随着浓度升高有促进作用。Cu2+在5~15 mmol/L时对酶活力有促进作用,当浓度为20 mmol/L时,对酶活力有抑制作用。3肌肉中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H 10.0;Mn2+、Ca2+对淀粉酶活力有促进作用;Pb2+在5~10 mmol/L时对酶活力有促进作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有抑制作用;Mg2+在5~10 mmol/L时对酶活力有抑制作用,在15~20 mmol/L时对酶活力有促进作用;Cu2+在5 mmol/L时对酶活力有促进作用,随着浓度升高,对酶活力有抑制作用。4消化腺中淀粉酶最适温度为40℃,最适p H为9.0;Ca2+在20 mmol/L时对淀粉酶活性有促进作用,低于此浓度有抑制作用。Pb2+、Mg2+、Cu2+和Mn2+对淀粉酶活性皆有不同程度的抑制作用。     

微量连苯三酚自氧化法测定SOD活性的条件优化

针对目前微量连苯三酚自氧化法测定SOD活性条件不一、测定结果重复性差的问题,实验考查不同保温时间、缓冲液体系、终止剂、加酶量等因素对SOD活性检测结果的影响,确定了最佳的检测条件为:pH7.8的0.9%生理盐水(内含1mmol/L Na_2EDTA)作为酶溶剂,以pH8.6的50mmol/L Tris-HCl(内含1mmol/L Na_2EDTA)作为缓冲体系,加入酶液保温20min,立即加入10μL 0.057mmol/L连苯三酚,反应3分钟后加入20μL 50g/L维生素C终止剂终止连苯三酚自氧化反应,于325nm波长下测定酶活性。在该条件下可以稳定地重复测定SOD活性,该方法可为SOD产品的活性检测提供参考依据。     

复合抑制剂对菊芋酶促褐变的影响

采用磷酸盐缓冲液提取菊芋中的多酚氧化酶(PPO),并对其酶学特性进行研究。结果表明,菊芋多酚氧化酶最适温度50℃、最适pH 值为4.0 和8.0。动力学实验表明菊芋PPO 的米氏常数Km 39.27mmol/L、最大反应速率Vmax 为1.369U/min。通过响应面试验设计对菊芋酶促褐变的抑制剂配方进行优化,结果表明：用质量度0.02g/100mL 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、0.02g/100mL 柠檬酸亚锡二钠和0.04g/100mL 的抗坏血酸复合溶液浸泡30min,能有效防止菊芋在加工期间的酶促褐变。     

米糠脂肪氧化酶活力的快速测定及其酶学特性研究

紫外分光光度法是测定脂肪氧化酶活力的常用方法,但其测定准确度受到底物溶液透明度和酶液纯度的制约,尤其在反应缓冲体系的pH低于7.0的条件下,难以进行粗酶液中LOX活力的直接测定。为克服现有方法的不足,本文建立一种改良的米糠中LOX紫外光谱检测方法。首先对米糠进行脱脂处理,提高方法的检测限与精确度;采用"磷酸盐溶液-亚油酸-吐温20"体系,简单、快速地获得透明的底物溶液;在获取米糠粗酶液LOX酶学特性的基础上,通过选择合适pH的缓冲体系,确保底物溶液的相对稳定;以"磷酸盐缓冲液+底物溶液+钝化的LOX溶液"为参比,省去繁杂的酶纯化步骤。结果表明:部分脱脂对米糠中脂肪氧化酶起到激活作用,其活力最高增加了46.33%;米糠LOX最适pH7.5,最适温度35℃;其活力测定的条件为:反应缓冲体系为2.0mL0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH7.5)、200μL底物溶液,其中亚油酸和吐温-20浓度分别是2.53×10-3mol/L、1.68×10-3mol/L,测定温度25℃。此优化条件下,粗酶液添加量在10～40μL范围,反应速率与酶浓度呈正比,△OD234/min=0.001V-0.0026(R2=0.9996);米糠LOX酶促反应最大速率Vmax=0.136△A/min,米氏常量Km=11.592×10-3mol/L。该方法能简便、快速和准确地进行米糠中LOX的活力测定以及酶钝化动力学研究。     

琥珀酸半醛脱氢酶GabD4的表达、纯化及酶学性质分析

人工合成琥珀酸半醛脱氢酶Gab D4基因,经蛋白表达和纯化,对其酶学性质进行研究。结果表明,Gab D4的最适反应温度为37℃;最适p H为7.5(磷酸盐缓冲液)或9.0(甘氨酸-氢氧化钠缓冲液);金属离子中,Cu2+对Gab D4酶活力的影响较大;Gab D4对3~5个碳的醛底物具有更高的催化效率;以乙醛为底物,计算得到米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)分别为6.86 mmol/L和20.6μmol/(min·mg protein)。该结果为深入了解Gab D4的酶学性质提供参考。     

文蛤纤维素酶分离纯化及性质

采用缓冲液提取、(NH4)2SO4分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析,从文蛤(Meretrix meretrix L)中分离纯化出一种纤维素酶。结果显示:纯化后的纤维素酶比活力达到40.33 U/mg,纯化倍数为13.12;SDS-PAGE检测其亚基相对分子质量为59 700;文蛤纤维素酶的最适pH为5.2,最适反应温度为45℃,该酶在p H 4～6和4～50℃范围内有较好的稳定;在最适条件下,以羧甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物测得其Km值为0.111 mmol/L。     

苯丙氨酸解氨酶仿生固定化及其稳定性研究

利用仿生硅化技术包埋固定化苯丙氨酸解氨酶(PAL),研究固定化条件对PAL固定化的影响及固定化PAL的稳定性。优化的固定化酶制备条件:0.06 m L浓度为6 mg/m L诱导剂聚乙烯亚胺(PEI),25 mmol/L磷酸盐(p H7.0)作为固定化反应介质体系,2 m L浓度为1 mol/L正硅酸甲酯(TMOS)水解液和1 m L(2 U/m L)酶液添加量,所得固定化酶的酶活最大回收率是70%。与游离酶相比,固定化PAL的温度稳定性、p H和储存稳定性,以及变性剂耐受性都有较大提高,重复使用5次,固定化PAL仍能保持初始酶活的40%。     

复合酶协同高压热水浸提法提取香菇多糖的研究

研究了采用复合酶协同高压热水浸提法从香菇中提取活性多糖的最适条件。通过单因素试验和正交试验,探讨了料液比、酶添加量、酶解时间、酶解温度和酶解p H对香菇多糖提取率的影响,并以香菇多糖提取率为评价指标,优化提取工艺。试验结果表明,复合酶协同高压热水浸提法提取香菇多糖的最适条件为:料液比为1∶40(g/m L),酶添加量为1%,反应70 min,酶解温度为60℃,p H为3。     

金鲳鱼内脏脂肪酶的初步纯化及鱼皮酶法脱脂的工艺优化

以金鲳鱼内脏为原料,采用磷酸盐缓冲液提取,硫酸铵分级沉淀的方法,初步纯化得到内脏粗脂肪酶;分别探讨了不同反应温度和p H对上述粗脂肪酶活力的影响;研究了酶在罗非鱼皮脱脂中的应用,并通过单因素实验和响应面实验优化了鱼皮酶法脱脂工艺。结果表明,经硫酸铵分级沉淀后,金鲳鱼内脏粗脂肪酶的比活力达12.60 U/mg,纯化倍数为6.06,纯度达81.65%;其最适温度为45℃,最适p H为8.0,在0~50℃及p H6.0~11.0的范围内酶活力较稳定。金鲳鱼内脏粗脂肪酶对罗非鱼皮脱脂实验结果表明,在酶添加量90 U/g,p H7.5,温度37℃,作用时间60 min的条件下,罗非鱼皮脱脂率达67.02%±1.61%,说明粗脂肪酶能在温和条件下有效脱除鱼皮脂肪。本研究为金鲳鱼加工废弃物的高值化利用提供了一定的理论依据。     

鲜食玉米脂氧合酶的酶学性质

本实验研究鲜食玉米脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)的酶学性质。以新鲜甜玉米、糯玉米籽粒及其胚为试材,采用紫外分光光度法,以亚油酸为底物,探讨了酶提取部位、酶促反应温度、pH值及底物浓度对LOX活性的影响。结果表明,鲜食玉米胚中LOX活性显著高于鲜食玉米籽粒,其最适反应温度为55℃,最适反应pH值为6.0,最适底物浓度为8.0mmol/L,提高温度和延长处理时间能有效地钝化LOX。     

圆蘑菇多酚氧化酶的特性研究

采用0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液匀浆法从圆蘑菇中提取多酚氧化酶(PPO),并对该多酚氧化酶的酶学特性进行研究.实验结果表明,以邻苯二酚为底物,该酶的最适pH为6.4,最适温度为30℃,Km值为0.032 3 mol/L,Vmax值为0.0164 U/min,100 ℃热处理1.5 min可完全钝化PPO的活力,10 mmol/L的EDTA、L-半胱氨酸或柠檬酸亚锡二钠能有效抑制PPO活力.