非酿酒酵母产生的β-葡萄糖苷酶在发酵酒中的应用研究进展

β-葡萄糖苷酶对糖苷键的水解作用已被广泛应用于酿酒、茶增香、保健品开发等领域.发酵环境中非酿酒酵母产生的β-葡萄糖苷酶活力高于酿酒酵母,可在酿酒酵母酶活力不足时进行补充.本文对发酵过程中不同的影响因素如酵母合成和释放β-葡萄糖苷酶的能力、发酵环境中的温度、酸碱度和可发酵糖浓度等对β-葡萄糖苷酶活力的影响进行了综述,并对...     

产β-葡萄糖苷酶酵母菌的分离鉴定及酶学特性

在葡萄酒自然发酵的初期,非酿酒酵母菌占主导地位,其产生的β-葡萄糖苷酶独特的水解活性,能够赋予葡萄酒特殊的香气。在新疆赤霞珠葡萄酒发酵过程中,通过对非酿酒酵母菌的采集与筛选,得到1株产β-葡萄糖苷酶能力较强的菌株;紫外-微波复合诱变后,酶活力增加1.81倍;经26S r RNA基因序列分析,鉴定为克鲁维毕赤酵母,并命名为XYN086(P.kluyveri XYN086);酶学性质研究表明:该菌株所产β-葡萄糖苷酶最适pH为6.0,在pH 6.0~8.0时酶活力保持60%以上;酶的最适作用温度为60℃,在60℃酶活力保持较好;金属离子依赖性实验表明,Fe2+和Cu2+对该菌株所产β-葡萄糖苷酶的酶活力均有激活作用,Mg2+、Ca2+、K+和Na+均有抑制作用,说明此菌株所产的β-葡萄糖苷酶对金属离子具有依赖性。据以上数据确认,该菌株为产β-葡萄糖苷酶克鲁维毕赤酵母。     

产β-葡萄糖苷酶非酿酒酵母的筛选及酶学特性研究

通过对新疆石河子葡萄产区葡萄中的酵母菌的筛选,采用酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基分离纯化菌株,并对分离菌株进行分子生物学鉴定。利用对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为底物筛选产β-葡萄糖苷酶酶酵母菌,得到一株高产糖苷酶毕赤酵母属(Pichia sp.)的非酿酒酵母菌株Y8,并研究该菌株的产β-葡萄糖苷酶酶学特性。结果表明,β-葡萄糖苷酶的最适初始p H值为5.0,最适产酶温度为30℃,反应时间为15 min,最适葡萄糖质量浓度为15 g/100 m L。     

大豆β-淀粉酶基因在毕赤酵母中的高密度发酵表达

大豆β-淀粉酶在麦芽糖浆生产上具有应用优势。该研究应用毕赤酵母表达系统异源表达大豆β-淀粉酶,并对重组酶的酶学性质进行了分析,结果显示,其酶学性质没有改变。为了增强重组β-淀粉酶的表达,采用甲醇/山梨醇混合碳源诱导的毕赤酵母表达策略,10 L发酵罐发酵表达的重组β-淀粉酶酶活力为310 U/mL,比单一甲醇诱导提高了36%。研究结果表明,发酵条件优化对提高异源β-淀粉酶在毕赤酵母中的表达有重要参考价值。     

树干毕赤酵母木糖醇脱氢酶基因表达载体构建及在酿酒酵母中的过表达

针对树干毕赤酵母xyl2基因设计相应引物。以p-AKRX为骨架载体,通过酶切连接的方式构建1个酿酒酵母工业菌株的表达载体p-AKRX2-2。将该表达载体线性转化酿酒酵母后,测定转化子SUN-Ⅰ木糖醇脱氢酶(XDH)及其表达情况。与原始菌株相比,重组酿酒酵母中的XDH活力是原始菌株的3.65倍。该重组质粒载体的构建可有效弥补酿酒酵母缺少代谢木糖关键基因的缺陷,为利用木糖高产乙醇酿酒酵母基因工程菌株的构建奠定基础。     

短小芽孢杆菌碱性β-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中的表达及酶学性质研究

以毕赤酵母密码子为基准,对短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因密码子进行优化,设计合成全基因序列,构建表达载体转入毕赤酵母中。结果表明,短小芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶基因已成功转入酵母菌中并分泌表达,诱导培养72h发酵液的酶活力可达25.39U/mL。重组酶最适反应温度45℃,最适pH 9.0,重组酶的K_m值1.26mmol/L,V_(max)为32.15μmol/(min·mg)。重组β-葡萄糖苷酶对大豆苷水解活性相对活力是pNPG的248%,转糖苷活性催化50%底物葡萄糖合成龙胆二糖,达34.25g/L。     

棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶I的毕赤酵母多拷贝体系构建及其在高密度发酵中的表达

β-葡萄糖苷酶目前广泛应用于合成烷基糖苷、芳基糖苷和辅助纤维素酶水解纤维素。本研究将来自棘孢曲霉(Aspergilus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶I(ABGL)在毕赤酵母中通过构建多拷贝表达盒的方法实现高效表达,利用同尾酶Bgl II/BamH I反复酶切和用DNA连接酶连接的方法,成功构建了含多拷贝表达盒5’AOX-ABGL-TT的pHKA-(ABGL)3的分泌重组质粒,并线性化重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过七叶苷显色筛选平板筛选获得高表达的GS115/pHKA-(ABGL)3菌株,且在50升发酵罐实现高密度发酵表达。研究表明,以pNPG为水解底物,在甲醇诱导120 h时摇瓶发酵液上清酶活可达83.15 U/mL,较之前报道的酶活提高了3.35倍;同时在50 L发酵罐实现高密度发酵,在甲醇诱导120 h时发酵罐上清酶活可达979 U/mL,较对照菌株的发酵罐上清液酶活提高2.94倍,且总蛋白表达量可以达到12 g/L。     

共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

通过分别共表达伴侣蛋白PDI和Bip获得β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物,以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段,插入表达载体p PICZαA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对β-甘露聚糖酶表达的差异。相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活达到40 900 U/m L,最高总蛋白表达量13.22 g/L,最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%,22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量和比活力,达到工业化生产水平。     

产β-D-葡萄糖苷酶酵母菌的筛选及产酶性质研究

以对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷(pNPG)法筛选产酶菌株,并进行酶活力定量分析。对产酶菌的种属定性采用5.8SrDNA-ITS区域RFLP分析的分子鉴定法。通过细胞破壁检测酶活力测定菌株的产酶定位。利用水杨苷和七叶苷为诱导物驯化菌株,提高其产酶能力。结果表明,从236株自选酵母菌中筛选出210株产酶菌株,区分为4种分子类型,分别为:有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora vineae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、葡萄汁有孢汉逊酵母(Hanseniaspora uvarum)和卡利比克毕赤酵母(Pichia caribbica)。产酶活性较高的8株酿酒酵母酶活性在0.0075~0.0099 U/mL之间,产酶定位均为:胞外酶胞内酶胞壁酶。水杨苷只对S4菌株产酶具有诱导作用,酶活力提高14%。而七叶苷可对S1和S4菌株产酶具有诱导作用,酶活力分别提高13%和19%。本研究筛选出8株高产β-D-葡萄糖苷酶的酿酒酵母,可用于生产葡萄酒。     

酿酒条件对两株商业酿酒酵母β-葡萄糖苷酶的影响

研究酿酒条件(氧气、pH值、温度、糖和乙醇等)对两株商业酿酒酵母β-葡萄糖苷酶的影响。结果显示:氧气促进酵母β-葡萄糖苷酶的合成,两株商业酿酒酵母完整细胞的β-葡萄糖苷酶最适pH值为5.0,最适温度为60℃,果糖、葡萄糖和蔗糖对两株酿酒酵母完整细胞的β-葡萄糖苷酶活性具有轻微抑制作用,乙醇(体积分数2%~20%)促进β-葡萄糖苷酶的酶活力。在葡萄酒发酵过程中,β-葡萄糖苷酶主要存在于完整细胞和透性化细胞中,上清液中酶较少。     

葡萄酒相关酵母β-葡萄糖苷酶活性及影响因素研究

以内蒙古西部地区分离到的6个属7个种共340株葡萄酒相关酵母菌株为材料,对产β-葡萄糖苷酶菌株进行初筛,进而采用对 硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）法检测菌株胞外、胞壁结合及胞内β-葡萄糖苷酶活力,并对高酶活性菌株中β-葡萄糖苷酶的理 化性质进行了研究。 结果表明,分属5个属5个种（葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、 浅黄隐球酵母（Cryptococcus flavescens）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）及星形假丝酵母（Candida stellata））的66株酵母菌株产β-葡萄 糖苷酶,且胞内酶活性均高于胞壁结合酶活性;不同菌株中β-葡萄糖苷酶具有相同的理化性质,4%以上葡萄糖可抑制该酶的活性, 5%～15%（V/V）的乙醇添加量对该酶活性无明显影响,其最适pH值为5.0～6.0,最适温度为40 ℃。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶在毕赤酵母中的克隆与表达

β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶是一类专一性降解β-1,3-1,4-葡糖苷键中的β-1,4-糖苷键,产生小分子还原糖的水解酶,广泛应用于啤酒工业和饲料工业中.本研究根据毕赤酵母密码子偏好性优化β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因序列,采用PCR法将其插入毕赤酵母表达载体pPICZαA,经Sac I线性化后电击整合入毕赤酵母X-33基因组,构建重组酵母;经菌落PCR验证和摇瓶筛选,获得一株X-33/pPICZαA-bgl,甲醇诱导96h后,酶活力达308.5U/mL,经SDS-PAGE电泳,实际蛋白分子量约为33ku.β-1,3-1,4-D-葡聚糖酶最适反应pH为5.0,最适反应温度为50℃.     

一株产α-葡萄糖苷酶菌株的鉴定和选育

通过平板初筛和摇瓶复筛,结合酿酒酵母利用可消化性糖和高效液相色谱法,从海泥中分离到一株产α-葡萄糖苷酶菌株YX41,纯化后经形态观察、生理生化特征和26 S rDNA序列及系统发育树分析,鉴定菌株YX41为伯顿毕赤酵母。通过UV-LiCl对出发菌株YX41进行复合诱变处理,获得一株正向突变株ZG36,该突变株经摇瓶发酵,α-葡萄糖苷酶活力达到4.32 U/mL,比出发菌株提高了32%。     

发酵小麦胚芽产2,6-二甲氧基对苯醌菌种筛选及发酵条件优化

该研究以小麦胚芽为原料,2,6-二甲氧基对苯醌（2,6-DMBQ）产量为评价指标,对发酵菌种进行筛选并考察原料预处理方式的影响。在此基础上,采用单因素试验及正交试验对发酵条件进行优化。结果表明,最适发酵菌种为低糖面包酵母;最佳原料预处理方式为超声处理;低糖面包酵母发酵小麦胚芽产2,6-二甲氧基对苯醌的最优发酵条件为菌种添加量1∶8（酵母与麦胚质量比）,料液比1∶15（麦胚与水质量比）,发酵时间42 h,发酵温度28 ℃。在此最优发酵条件下,2,6-二甲氧基对苯醌的产量最高为（765.23±9.11） μg/g。     

毕赤酵母高效表达重组β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导方法研究

将甘草酸生物转化合成GAMG已成为国内外医药和食品行业研究的热点。该文在前期构建毕赤酵母(pichia pastoris)工程菌GS115-GUS的基础上,对重组毕赤酵母工程菌发酵条件进行了研究。通过单因素及正交试验建立工程菌最佳表达β-葡萄糖醛酸苷酶的诱导产酶方法:重组毕赤酵母GS115-GUS菌株在液体YPD培养基中活化24 h后,接种到BMGY中富集菌体,OD600达到6.0时,按照1∶1(V/V)的接种比率接入到pH为6.0的BMMY培养基中,加入1.5%诱导剂甲醇诱导产酶,且每隔24 h添加一次。该诱导产酶条件简单、易行、科学、合理,毕赤酵母高效表达GAMG的酶活高达1.97×103 U/mL,研究结果达到预期目标,为进一步研究重组酵母工程菌产β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵水平、β-葡萄糖醛酸苷酶生物催化甘草酸制备GAMG以及工业化生产奠定基础。     

产β-糖苷酶菌株的筛选及酶活的研究

利用对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷为底物筛选酿酒酵母菌,得到1株高产糖苷酶的酿酒酵母菌。以该菌株作为实验菌株,研究该菌株的酶活特性,对酿酒酵母菌酶活性测定条件进行研究。通过单因子试验,确立了该菌株发酵对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷酶的最适培养条件：pH4．0,温度为40℃,发酵时间为6h。高浓度的葡萄糖、果糖对酶活没有抑制作用,酒精度超过14％vol时对产酶有抑制作用。     

高产酸性β-葡萄糖苷酶的优良本土酵母菌株筛选、鉴定及酶学性质分析

为获得高产酸性β-葡萄糖苷酶及对葡萄酒生境耐受性良好的本土非酿酒酵母菌株,该文从452株本土非酿酒酵母菌株中通过逐步分析菌株发酵力、耐受性、高产β-葡萄糖苷酶能力和粗酶液的酶学性质,筛选目标酵母菌株。结果表明,452株非酿酒酵母菌株中72 h的CO₂失重量>0.51 g/100mL的菌株有221株;高产β-葡萄糖苷酶的菌株34株;菌株GC204、NM218、ZC278、ZC287、BF345、BF370对葡萄糖、SO₂、酒精度和pH值均具有较好的耐受性,分别能耐受高糖350 g/L、酒精3%～6%（体积分数）、SO₂ 250 mg/L和低pH值2.5;其中菌株GC204、NM218、BF345均具有较高的β-葡萄糖苷酶活力,分别为54.34、49.5、46.42 mU/mL。酶学性质分析表明,菌株NM218和BF345中的β-葡萄糖苷酶最适反应温度为40℃,最适pH值为4.0;浓度为5 mmol/L的Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、Fe^3+<...     

“赤霞珠”葡萄自然发酵过程中高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株筛选分析

本实验以新疆天山北麓葡萄酒产区成熟赤霞珠浆果为原料,自然发酵筛选得到产β-葡萄糖苷酶的优良酵母,利用WL培养基和赖氨酸培养基分类、糖类发酵、碳氮源同化试验及及18S rDNA分子鉴定。结果表明:产β-葡萄糖苷酶酵母(G8、G13、G17、G19、G21)菌株均为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)且G13、G21菌株在14%乙醇浓度下酶活力分别为37.21、35.51 U/mL,25%高糖浓度下保留30%的最大酶活,分别为13.87、11.83 U/mL,pH3.0条件下保留40%的最大酶活分别为19.18、18.31 U/mL,表明菌株具有良好的产β-葡萄糖苷酶能力,有望在葡萄酒酿造中加以应用,生产具有地域特色的葡萄酒。     

黑曲霉单宁酶基因在毕赤酵母中的表达

单宁酶(EC3.1.1.20)在食品、化工及医药等领域应用广泛,期望通过单宁酶在毕赤酵母中的表达来提高单宁酶的产量。以经室温常压等离子体诱变技术诱变得到的较高产单宁酶的黑曲霉B1401的总DNA为模板,PCR扩增获得单宁酶基因(tan)后构建重组表达载体pPIC9K-tan,通过电转化至毕赤酵母GS115,利用甲醇诱导培养重组菌获得单宁酶。单宁酶的最适反应温度为30℃,最适反应pH为5.0,最高酶活力可达到34.25 U/g,相较于黑曲霉B1401产单宁酶活力提高了1.38倍,Ca~(2+)、Fe~(3+)、Mn~(2+)等金属离子对重组单宁酶酶活力影响不大。实验结果表明实现了单宁酶在毕赤酵母中的高效表达。     

甘肃河西走廊葡萄酒产区高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株筛选

以甘肃河西走廊葡萄酒产区成熟葡萄浆果自然发酵过程中分离得到的115 株酵母菌株为出发菌株,采用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物的平板初筛,摇瓶复筛,对高产β-葡萄糖苷酶酵母菌株进行WL营养培养基和赖氨酸培养基初步分类以及26S rDNA D1/D2区序列分析。结果表明：6 株酵母β-葡萄糖苷酶活性与商业酵母ICV-D254酶活性相似,酶活力可达（51.40±4.74） mU/mL,其中菌株QLFE、MQFEH-1、MQFSC-3、MQFEH-2和MQFSM-3为酿酒酵母属,菌株QLFE-4为梅奇酵母属,与分子鉴定结果一致。