大肠杆菌丝氨酸转运系统单基因敲除对丝氨酸生产的影响

氨基酸转运系统改造是一种重要的氨基酸菌种选育方式。sda C,cyc A,sst T和tdc C是目前报道的大肠杆菌中与L-丝氨酸转运吸收相关的四个基因,本研究以实验室前期构建的L-丝氨酸工程菌SWCH-05为基础,采用Red重组系统,分别构建了sda C,cyc A,sst T和tdc C单基因敲除菌,并通过补料分批发酵实验考察了转运吸收基因缺失对菌株产L-丝氨酸的影响。发酵结果表明,sda C敲除菌L-丝氨酸产量达到了16.3 g/L,与出发菌株相比提高了43%,cyc A敲除菌L-丝氨酸产量为14.1 g/L,与出发菌株相比提高了25%,而sst T和tdc C基因敲除菌的L-丝氨酸产量均与对照菌相近。      

ptsG/mglB双基因敲除对大肠杆菌发酵混合糖产L-乳酸的影响

为增强大肠杆菌（Escherichia coli）JH16利用混合糖产L-乳酸的能力,通过Red同源重组技术敲除葡萄糖转运酶基因ptsG和半乳糖转运基因mglB,构建重组菌E. coli JH2705。结果表明,以8%混合糖（5.6%葡萄糖和2.4%木糖）为碳源,ptsG/mglB双基因缺陷重组菌E. coli JH2705同时可利用葡萄糖和木糖,大幅减小葡萄糖效应带来的不利影响,其木糖利用速率为0.60 g/（L·h）,L-乳酸生产强度为1.27 g/（L·h）,较出发菌株E. coli JH16分别提高50%和79.1%,E. coli JH2705的糖酸转化率高达70%,为利用木质纤维素等可再生原料高效生产L-乳酸提供技术参考。     

糖蜜对重组谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

重组谷氨酸棒杆菌SYPS-062 33a△SSA-PS能够利用蔗糖直接发酵产L-丝氨酸。本文比较了不同的糖蜜预处理方法及其添加量对该重组菌的生长及产L-丝氨酸的影响,并进一步分析了糖蜜对丝氨酸合成相关途径中关键酶基因转录水平的影响。结果表明,糖蜜替代蔗糖作为唯一碳源时对产物合成并不利,但在蔗糖培养基中添加少量硫酸预处理的糖蜜有利于该菌的生长和产物积累。当其添加量为总糖量0.24%时,菌株生长最好,OD562可达76.37,L-丝氨酸产量为32.76 g/L,比未添加糖蜜的对照组分别提高了23.82%和29.44%。qRT-PCR结果表明,添加低质量分数糖蜜可显著提高EMP途径中关键酶基因的转录水平,这可能是促进产物积累的主要原因之一。     

代谢工程改造大肠杆菌生产L-丝氨酸

L-丝氨酸是一种具有重要生理学功能的中性氨基酸,广泛应用在食品、化妆品和医药等领域.为构建L-丝氨酸的生产菌株,对Escherichia coli MG1655进行了系统的代谢工程改造.采用的方法策略包括减弱L-丝氨酸的降解,增强L-丝氨酸合成酶类的表达以及转运系统的改造.特别是利用启动子Ptrp调控丝氨酸羟甲基转移酶...     

加强表达3-磷酸甘油醛脱氢酶对谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中,由3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)催化的反应是糖酵解途径的限速步骤,该反应还直接影响了L-丝氨酸的前体3-磷酸甘油酸的合成。研究首先比较了产L-丝氨酸的野生型菌株C.glutamicum SYPS-062与模式菌株C.glutamicum ATCC14067的GAPDH酶活力,发现SYPS-062的GAPDH酶活力比ATCC14067高了55.8%。进一步采用在C.glutamicum33a△SS基因组上增加gap A拷贝数的方法加强表达GAPDH,构建了重组菌C.glutamicum33a△SS-2gap A。重组菌GAPDH转录水平和酶活力分别提高119%和53%,最大比生长速率提高10.6%,总糖耗速率提高4.4%,L-丝氨酸产量提高17.4%,糖酸转化率提高12.2%,生产强度提高17.4%。结果表明,加强表达GAPDH能够提高重组菌的生长和糖耗速率,并能够提高L-丝氨酸的产量、糖酸转化率和生产强度。     

色氨酸转运系统改造对大肠杆菌产L-色氨酸的影响

近年来,转运系统改造已经成为氨基酸菌株菌种改良的重要手段。本研究以工业生产菌Escherichia coli MT-01/p Trp-01为出发菌株,首先利用Red重组技术,在菌株MT-01/p Trp-01基因组上敲除了色氨酸吸收基因mtr,发酵结果表明,敲除敲除突变菌的L-色氨酸产量达到35.87 g/L,与出发菌株E.coli MT-01/p Trp-01相比提高了32%;在此基础上,进一步考察了三种不同启动子（Pr,Ptac,Pser A）控制下L-色氨酸分泌基因ydd G的差异表达对菌体生长及菌株产L-色氨酸的影响。结果表明,当采用组成型启动子tac时,ydd G基因的过表达菌株L-色氨酸的产量为41.01 g/L,比mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量提高了14.3%,当采用温度诱导型启动子Pr调控ydd G基因表达时,L-色氨酸的产量与mtr敲除菌株E.coli MT-11/p Trp-01的产量相比提高了9.3%,L-色氨酸的产量达到了39.22 g/L;而采用基因ser A的天然启动子调控ydd G表达时,菌体的生长受到了明显抑制,L-色氨酸产量仅有27.1 g/L的色氨酸。综上,大肠杆菌基因mtr的敲除和基因ydd G的过表达均可以有效提高工程菌株生产色氨酸的能力。      

直接发酵法生产L-丝氨酸高产菌株的选育

为了解除高浓度L-丝氨酸对3-磷酸甘油酸脱氢酶的反馈抑制,进一步提高L-丝氨酸的产量,以一株能直接利用糖质原料发酵生产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062-36为出发菌,经硫酸二乙酯逐级诱变处理,在D-丝氨酸抗性梯度平板上挑取正突变株,获得一株遗传性能稳定的高产菌株SYPS-062-33a-18,其可积累L-丝氨酸(11.0±0.25)g/L,较出发菌L-丝氨酸产量(6.65±0.23)g/L提高了65.4%。说明本研究不仅以D-丝氨酸作为抗性平板筛选得到高产L-丝氨酸的突变株,而且为下一步进行反向代谢工程的研究提供了良好的实验材料。     

调控NADH/NAD~+对重组谷氨酸棒杆菌产L-丝氨酸的影响

在谷氨酸棒杆菌中,L-丝氨酸由糖酵解中间产物3-磷酸甘油酸经过3步反应生成,这个过程产生2个NADH,而L-丝氨酸的合成过程并不涉及NAD~+的生成,多余的NADH是否会影响菌株的生长及产L-丝氨酸?该研究通过外源添加NAD~+的前体物质烟酸,内源表达NADH氧化酶编码基因nox A,考察调控NADH/NAD~+对Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI生长和产L-丝氨酸的影响。结果表明,添加不同浓度烟酸,菌株的L-丝氨酸产量、生物量及糖耗较未添加时略有提高。而通过加强表达NADH氧化酶编码基因nox A,构建重组菌Corynbacterium glutamicum SYPS-062 33aΔSSAAI-nox A,重组菌中NADH氧化酶比酶活是出发菌的11.6倍,L-丝氨酸产量达到28.93 g/L,较出发菌提高9.0%,糖酸转化率达到0.29 g/g蔗糖,较出发菌提高7.4%,OD562最大值为51.38,较出发菌提高6.6%,说明NADH氧化酶的过表达能够促进重组菌株的生长及碳源利用,提高菌株的L-丝氨酸产量。     

外源调控叶酸代谢对谷氨酸棒杆菌SYPS-062积累L-丝氨酸的影响

通过外源添加叶酸合成前体对氨基苯甲酸、叶酸途径抑制剂氨甲喋呤扰动叶酸代谢,考察了叶酸对谷氨酸棒杆菌SYPS-062合成L-丝氨酸的影响。实验结果表明,添加对氨基苯甲酸(0~0.4μg/mL)能够促进菌体的生长(最大值为7.8±0.24 g/L),但可显著降低其产酸能力;而添加氨甲喋呤(0~100μg/mL)抑制了谷氨酸棒杆菌SYPS-062的生长,但可提高其单位菌体产酸的能力;代谢通量分析表明,作为调控点的叶酸代谢在SYPS-062生长及积累L-丝氨酸中占主导地位。     

L-丝氨酸的微生物法制备研究进展

L-丝氨酸作为胞内中心代谢产物,参与了胞内重要的C-1活性单元循环,其降解代谢的部分分支途径不能被直接敲除,与其他氨基酸相比,微生物法制备难度较大。以往采用传统的育种方法均难以获得高产L-丝氨酸的菌株,目前的制备方式以微生物前体转化为主。近几年,随着现代生物技术的快速发展,胞内代谢通量的实时分析和遗传改造技术不断增强,人们开始重新关注从糖质原料合成L-丝氨酸的育种研究,并应用多种代谢工程策略改造菌株。该文从L-丝氨酸作为中心代谢产物的特征、微生物前体转化的制备技术以及从糖质原料合成丝氨酸的代谢工程改造3个方面进行阐述,分析微生物法制备L-丝氨酸的相关进展以及存在问题。     

ldhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TCCC11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△ldh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因ldhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的。结果表明,与出发菌株相比ldhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6%,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6%和5.5%,但生物量略有下降。本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考。     

表面活性剂对大肠杆菌产L-鸟氨酸的影响

系统研究了表面活性剂种类(Tween-40、Tween-60、Tween-80、曲通-X-100(Triton X-100)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化胺(CTAB))、表面活性剂添加浓度以及表面活性剂添加时间对大肠杆菌BW25113生长和发酵产L-鸟氨酸的影响。研究结果表明,发酵0h添加浓度范围为0.1g/L 2g/L的表面活性剂时,Tween-40、Tween-60、Tween-80、Triton X-100和SDS对大肠杆菌BW25113的生长和L-鸟氨酸的产量均无影响,而CTAB对L-鸟氨酸生物合成有一定的促进作用。CTAB的作用效果因CTAB的添加浓度和添加时间的不同而有所差异。发酵8h添加与0.1g/L为CTAB最适添加时间和最佳添加浓度。在该条件下,添加CTAB对大肠杆菌BW25113发酵产L-鸟氨酸的促进作用最大,L-鸟氨酸产量可达743mg/L并且几乎不影响大肠杆菌BW25113的生长。与不添加CTAB的对照组相比,L-鸟氨酸产量提高1.25倍,发酵周期也缩短10h。     

1dhA基因敲除对Corynebacterium glutamicum TCCC11822 发酵生产L-谷氨酸的影响

针对L-谷氨酸发酵过程中乳酸产量偏高的问题,以L-谷氨酸生产菌谷氨酸棒杆菌（Corynebactenum glutamicum） TCCC 11822为出发菌株,通过构建敲除质粒pK18mobsacB△1dh并采用同源重组技术敲除其乳酸脱氢酶编码基因1dhA,以期达到减少副产物、提高L-谷氨酸产量和转化率的目的.结果表明,与出发菌株相比1dhA基因敲除株的乳酸合成量降低了85.6％,L-谷氨酸的产量和转化率分别提高7.6％和5.5％,但生物量略有下降.本研究可为L-谷氨酸及其他氨基酸生产菌株的理性改造提供参考.     

利用纸层析-分光光度法检测甲基营养菌5222产L-丝氨酸

该研究旨在建立一种准确、简便的检测L-丝氨酸含量的方法。当纸层析-分光光度法展开剂为丙酮∶正丁醇∶二乙胺∶水（10∶10∶2∶5,V/V）,pH值为12.7,波长为510 nm,洗脱时间为30 min时,能很好的对L-丝氨酸进行定性、定量检测。当L-丝氨酸标准溶液质量浓度在1～6 μg/mL时,L-丝氨酸的含量（x）与吸光度值（y）之间有良好的线性相关关系（回归方程y=0.008 8x+0.008 9,R2=0.996 2）;精密度实验结果显示相对标准偏差（RSD）为2.3%;回收率实验结果显示平均加标回收率95.3%,RSD为2.6%。说明该方法具有较高的精密度和准确度。以甲基营养型菌（Methylobacterium sp.）5222为出发菌株,以甘氨酸为前体物质发酵生产L-丝氨酸,应用该研究建立的纸层析-分光光度法,检测到发酵液中L-丝氨酸含量为0.90 g/L,说明菌株5222具有产L-丝氨酸的能力。     

谷氨酸棒杆菌苏氨酸脱氨酶基因敲除及对L-亮氨酸发酵的影响

L-异亮氨酸是L-亮氨酸发酵的主要副产物,L-异亮氨酸的积累对L-亮氨酸的发酵及提取均产生不利影响。采用基因重组技术敲除L-亮氨酸产生菌-谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)TGL8207的苏氨酸脱氨酶基因ilvA,构建了ilvA缺失株谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)TGL8207 ilvA。发酵结果显示:ilvA基因缺失对TGL8207 ilvA的生长影响很小。与供试菌比较,TGL8207 ilvA的L-亮氨酸产量和糖酸转化率分别提高了8.4%和1.9%。     

酶法产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺重组大肠杆菌pepD/pepN基因的敲除及其发酵优化

L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,L-Ala-L-Gln),是目前国内外公认的L-谷氨酰胺载体,在临床医学和营养学等领域有广泛应用。为了减少丙谷二肽在生物酶法生产过程中菌体对其降解,利用λRed同源重组系统,敲除大肠杆菌中肽酶D和氨肽酶对应的编码基因。与野生型菌株相比,双敲除突变菌株的全细胞酶活提高了0.29倍。对该菌株进行摇瓶发酵优化,得到最优培养基为(g/L):葡萄糖12、酵母提取物10、胰蛋白胨10、(NH_4)_2SO_4 1、KH_2PO_4 3、K_2HPO_4 1、MgSO_4 0.2;最优发酵温度为27℃;最佳反应条件为:Gln 200 mmol/L、Ala-Ome·HCl 200 mmol/L,反应p H 8.5,反应温度25℃。在最优条件下发酵36 h,丙谷二肽产量达到了14.51g/L反应液,是优化前的4.74倍。     

纸层析-分光光度法测定发酵液中L-丝氨酸和甘氨酸的含量

应用“纸层析 分光光度法”对发酵液中的L 丝氨酸和甘氨酸进行了定性分析和定量测定,确立了L 丝氨酸和甘氨酸定量测定条件。研究结果表明,该法对测定L 丝氨酸和甘氨酸含量具有较高的准确度和精密度。而且该法操作简单、易于掌握,非常适合在L 丝氨酸产生菌筛选中应用。     

产高纯度L-乳酸大肠杆菌基因工程菌的初步研究

本文以鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)基因组为模板,扩增出L-乳酸脱氢酶基因ldh,将其连接到表达载体pSE380,转化到D-乳酸脱氢酶及丙酮酸甲酸裂解酶双缺失的大肠杆菌FMJ144中,摇瓶发酵得到3.5g/L的高纯度为99%的L-乳酸。     

培养基影响大肠杆菌产L-天冬酰胺酶的研究

研究培养基的成分及添加量对大肠杆菌产生抗癌药物-L-天冬酰胺酶的影响.通过对大肠杆菌培养基中碳源、氮源以及微量元素的讨论,得知该菌株以蔗糖为碳源,添加量为0.7%,以0.5%牛肉膏 1.0%蛋白胨为氮源,添加0.01%的硫酸亚铁为微量元素,所产L-天冬酰胺酶的比酶活达到352.54 U/g,相比基本培养基培养提高了31%.     

培养条件影响大肠杆菌产L-天冬酰胺酶的研究

研究了培养温度、培养时间、初始pH和摇床转速等培养条件对所选大肠杆菌(E.coli No TN1.5885)产L-天冬酰胺酶的影响.实验结果表明,该菌株进行摇瓶培养最为适宜的培养条件为:培养温度37%,培养时间为16h,初始pH为7.0～7.5,摇床转速约为300r/min,其比酶活力达到约406U/g,相比较优化前提高了约20%.