副干酪乳杆菌及其胞外多糖的抗氧化性研究

以具有抗氧化性的嗜酸乳杆菌ATCC4356为对照,研究了1株副干酪乳杆菌H9的抗氧化性。分析了2株菌不同浓度下菌悬液和无细胞提取液的DPPH自由基清除能力、金属离子螯合能力和抑制脂质过氧化能力。并对H9菌株菌悬液煮沸灭活前后的抗氧化能力进行了比较。同时,对H9菌株自产的胞外多糖的抗氧化性进行了研究,测定了其在不同浓度下DPPH自由基清除能力、超氧自由基清除能力、羟自由基清除能力。结果表明:H9菌株的菌悬液和无细胞提取液抗氧化能力均随着浓度的升高呈上升趋势,浓度达到109cfu/mL时抗氧化能力最强,此时DPPH的清除能力分别达到(55.0±1.7)%和(47.5±1.8)%,螯合金属离子的能力分别为(15.2±1.2)%和(15.1±1.3)%,抑制脂质过氧化的能力分别为(76.2±1.1)%和(70.0±0.4)%。煮沸后菌悬液抗氧化能力趋势与未煮沸前一致,但同等浓度下煮沸处理会降低其抗氧化能力。H9菌株自产胞外多糖也具有较强的抗氧化能力,并随着多糖浓度的升高抗氧化能力增强。结果表明H9菌株的抗氧化性可能与活细胞和菌体代谢产物密切相关。     

副干酪乳杆菌胞外多糖抗氧化活性分析

为评价干酪乳杆菌生物合成胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)抗氧化活性,本文分离纯化高产胞外多糖的三株副干酪乳杆菌(3号、5号和7号)的胞外多糖,并对其DPPH·、·OH和O₂^-清除率分别进行测定,评价其体外抗氧化活性。通过分析EPS对H₂O₂诱导氧化损伤293T细胞的保护作用,评价其胞内抗氧化活性。结果表明,当EPS浓度为400 μg/mL时,其DPPH·、·OH和O₂^-的清除率最高,分别为8.87%(5号)、88.94%(7号)和34.55%(7号),其中对·OH清除能力高于抗坏血酸(65.87%),且三株菌株之间没有明显差异。3号副干酪乳杆菌所产EPS显著提高超氧化物歧化酶(SOD)活性、总抗氧化能力(T-AOC)活性并抑制了丙二醛(MDA)的生成(P<0.05),且与多糖浓度呈正相关。因此,3株副干酪乳杆菌胞外多糖具有良好的抗氧化活性,作为天然抗氧化剂具有良好的应用潜力。     

副干酪乳杆菌VL8胞外多糖对巨噬细胞RAW264.7免疫激活作用研究

旨在研究副干酪乳杆菌VL8胞外多糖(Lactobacillus paracasei VL8 exopolysaccharides,VL8-EPS)对巨噬细胞RAW264.7的免疫激活作用。试验采用不同浓度的VL8-EPS作用于RAW264.7细胞,设空白对照组,脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理组(终浓度为10μg/mL)和VL8-EPS处理组(终浓度为50、100、200、400、800μg/mL)。迪夫快速染色法观察细胞形态;比色法测定诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)活力;WST-1法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力;微量法检测超氧阴离子(O2-)的含量;钼酸显色法检测过氧化氢(H2O2)的分泌量。结果表明,VL8-EPS能够改变细胞形态,剂量依赖性提高RAW264.7细胞内iNOS、SOD酶活力,促进细胞分泌O2^-和H2O2。在800μg/mL时,较空白对照组分别提高了104.64%、10.30%、666.87%、81.78%。说明VL8-EPS通过提高胞内酶活性及释放活性氧激活RAW264.7细胞从而发挥免疫增强作用。     

干酪乳杆菌KW3产胞外多糖的研究

从西藏农家开菲尔粒中筛选出1株高产胞外多糖(EPS)的乳酸菌KW3,生理生化试验和16S rDNA测序结果经鉴定其为干酪乳杆菌,在乳清培养基中的胞外多糖产量达到178mg/L。体外抗氧化试验表明:KW3胞外多糖总还原力达到(138.28±5.35)mgVC/g;当其质量浓度达到200μg/mL时,对DPPH自由基的清除率37.53%,FRAP值为(600.16±15.23)FeSO4.7H2Oμmol/L。体内抗氧化试验显示KW3胞外多糖可显著降低衰老小鼠血清、肝和脑组织中的MDA含量,提高其SOD活性和GSH-Px活性。     

干酪乳杆菌胞外多糖LCP1的流变性研究

通过对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖LCP1溶液流变性质研究发现,高浓度LCP1溶液呈剪切变稀,低浓度时,剪切速率对黏度没有影响,溶液黏度随温度升高下降明显,pH对LCP1溶液黏度影响很小,盐可以降低LCP1溶液黏度,但黏度降低与盐浓度有关,通过黏弹性研究发现LCP1水溶液不能形成胶体,乌氏黏度计测得LCP1水溶液固有黏度[η]为1.930 dL/g。     

高产胞外多糖干酪乳杆菌的太空诱变选育

为了提高干酪乳杆菌G5的胞外多糖产生能力,采用太空诱变技术对其进行选育,从中筛选出高产胞外多糖菌株。通过富集培养、平板筛选、脱脂乳发酵和遗传稳定性实验,最终得到两株高产胞外多糖且遗传稳定性较好的突变株EPS-33和EPS-43。突变株EPS-33和EPS-43在25℃发酵脱脂乳,发酵结束时胞外多糖的产量分别220.42和198.49mg/L,为出发菌株的1.9倍和1.7倍。2个突变菌株与出发菌株产胞外多糖的变化趋势基本相同,但产量大幅增加。     

干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的体外免疫活性研究

分别以葡萄糖、乳糖为碳源制得干酪乳杆菌LC2W胞外多糖,并对分别分离纯化得到的中性多糖组分体外细胞培养试验结果表明,G1、G2（以葡萄糖为碳源经LC2W发酵分离纯化制备两种均一多糖）和L1、L2（以乳糖为碳源经LC2W发酵分离纯化制备两种均一多糖）均无细胞毒性,在5~80 μg/mL的浓度范围内,L1对B淋巴细胞增殖的抑制作用比G1强,具有明显的剂量效应,其抑制作用与浓度呈负相关;与此相反,在5~80 μg/mL的浓度范围内,G2对B淋巴细胞增殖抑制作用比L2强,表现为明显的剂量效应,其抑制作用与浓度呈正相关。碳源的改变会影响干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的组成,并引起其生理活性产生差异。     

干酪乳杆菌LC2W合成胞外多糖培养基成分的优化

研究了不同培养基对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖产量的影响，并研究了以脱脂乳为基础培养基，添加不同碳源、氮源和其他盐类对LC2W胞外多糖产量的影响。结果表明，不同培养基对LC2W胞外多糖产量影响较大，其中PTYG和脱脂乳培养基胞外多糖产量较高；以脱脂乳培养基为基础培养基，添加质量分数1．0％大豆蛋白胨、1．5％葡萄糖、0．1％的K2HPO4可以提高胞外多糖产量28.75％。     

一株高产胞外多糖降血糖副干酪乳杆菌JY062(TD062)的黏附性与耐受性评价

以分离自西藏传统发酵乳制品中的副干酪乳杆菌JY062（原副干酪乳杆菌TD062）为试验菌株,测定此菌株的胞外多糖产量、对Caco-2细胞的黏附性以及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性,并分析测定其体外耐受性能。结果表明副干酪乳杆菌JY062的胞外多糖的产量为0.69 g/L,黏附性为91.2%,对α-葡萄糖苷酶的抑制率为57.36%。综合判定副干酪乳杆菌JY062为高产胞外多糖的菌株,此菌株黏附性能好,具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性,说明该菌株可以利用其分泌的胞外多糖,提高黏附在宿主肠道的性能,进而发挥降血糖的功能活性。且该菌株具有较高水平的环境耐受能力,是一株具有广阔应用前景的潜在功能性益生菌。     

干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的分离纯化及性质研究

干酪乳杆菌LC2W发酵脱脂乳上清液通过添加三氯乙酸除蛋白，酒精沉淀得粗胞外多搪LCP；粗多糖LCP经DE-AE-Sepharose FF离子交换柱分离得到三个组分（LCP1、LCP2和LCP3）．主要组分LCP1经高效体积排阻色谱和毛细管电泳鉴定为均一组分，分子量为3.27×10^6 Da。紫外光谱测定表明：LCP1不含蛋白质和核酸；红外光谱测定表明：LCP1具有多糖的特征吸收峰；气相色谱测其单糖组成（质量比）为鼠李糖：半乳糖：葡萄糖=0.4353：0.2514：1。     

NADH氧化酶表达对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖产量的影响

为了考察NADH氧化酶基因(nox)对于干酪乳杆菌LC2W胞外多糖(EPS)产量的影响,本研究以变异链球菌(Streptococcus mutans)基因组为模板,PCR扩增得到1374 bp的nox序列,并构建乳杆菌重组表达质粒p IB184-nox。通过电转化,构建得到一株过表达NADH氧化酶基因的重组干酪乳杆菌LC-nox。该重组菌在无氧发酵时,NADH氧化酶活力为0.7 U/m L,在有氧发酵时,NADH氧化酶活力达到2.65 U/mL。通过HPLC检测发现,发酵液中的乳酸含量随NADH氧化酶活力升高而降低。节省的碳源用于EPS合成,使得重组菌LC-nox在有氧条件下EPS产量最高达263.7 mg/L,比出发菌株提高75.4%。为乳杆菌EPS合成调控提供了新的理论基础。     

NADH氧化酶表达对干酪乳杆菌LC2W胞外多糖产量的影响

为了考察NADH氧化酶基因（nox）对于干酪乳杆菌LC2W胞外多糖（EPS）产量的影响,本研究以变异链球菌（Streptococcus mutans）基因组为模板,PCR扩增得到1374 bp的nox序列,并构建乳杆菌重组表达质粒p IB184-nox。通过电转化,构建得到一株过表达NADH氧化酶基因的重组干酪乳杆菌LC-nox。该重组菌在无氧发酵时,NADH氧化酶活力为0.7 U/m L,在有氧发酵时,NADH氧化酶活力达到2.65 U/mL。通过HPLC检测发现,发酵液中的乳酸含量随NADH氧化酶活力升高而降低。节省的碳源用于EPS合成,使得重组菌LC-nox在有氧条件下EPS产量最高达263.7 mg/L,比出发菌株提高75.4%。为乳杆菌EPS合成调控提供了新的理论基础。      

干酪乳杆菌胞外多糖基因簇的调控基因在大肠杆菌中异源表达

为研究干酪乳杆菌胞外多糖的生物合成和转录调控,对其生物合成基因簇中假定的转录调控因子LC2W_2170进行克隆,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达。首先,利用PCR技术从干酪乳杆菌LC2W中扩增出目的基因LC2W_2170,将其插入到大肠杆菌表达载体p ET24a和p ET30a中,构建出LC2W_2170 N端或C端和N端均含有His蛋白标签的重组质粒。含上述质粒的E.coli经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析并未发现LC2W_2170蛋白可溶性表达。对LC2W_2170氨基酸序列利用Phobius服务器分析,发现该蛋白N端存在跨膜区(前27个氨基酸为跨膜序列)。切除此跨膜区域重新构建重组表达质粒后,在E.coli中成功实现LC2W_2170蛋白可溶性表达。研究为进一步纯化该转录调控因子,并研究其功能和对胞外多糖生物合成基因簇的转录调控机制奠定了基础。     

植物乳杆菌胞外多糖对小鼠树突状细胞分泌的调控

采用细胞因子诱导法,以加入重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)、重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)及10%胎牛血清的RPMI1640为完全培养基培养树突状细胞(DCs)。实验组加入植物乳杆菌胞外多糖,脂多糖LPS和RPMI1640分别作为阳性和空白对照。采用Griess法和双抗体夹心ELISA检测DCs分泌NO,促炎症因子IL-12p70,抗炎症因子IL-10和趋化因子RANTES的浓度。结果表明:植物乳杆菌胞外多糖刺激DCs后,DCs分泌NO、IL-12p70、IL-10和RANTES的浓度分别是空白组的110%、194%、76%和133%,且呈剂量依赖关系。植物乳杆菌胞外多糖能促进小鼠骨髓来源的DCs分泌能力。     

产胞外多糖干酪乳杆菌的筛选鉴定及galU基因克隆与分析

乳酸菌胞外多糖具有良好的功能特性。从泡菜中分离乳酸菌,初筛到11株产胞外多糖的乳酸菌。经黏度及EPS产量测定,复筛出1株高产EPS的乳酸菌,其产量为771.97μg/m L。采用CTAB法提取该菌株基因组,测定其16S r RNA序列,在NCBI上进行同源序列比对,建立系统发育树。结果初步确定该菌株为干酪乳杆菌ZJ-4(Lactobacillus casei ZJ-4)。以该菌株基因组为模板,参照干酪乳杆菌BL23(HM162415)的gal U序列设计引物。采用Touch-down PCR扩增得到大约900 bp的gal U序列,经TA克隆、测序,与干酪乳杆菌BL23(HM162415)的gal U序列同源率为98%,表明克隆正确。     

益生菌干酪乳杆菌FM10-3产胞外多糖培养条件的优化

通过单因素试验分析,确定合适的FM10-3合成胞外多糖的温度、时间、pH值和接种量;在单因素试验基础上利用Design-Expert软件对产胞外多糖的三个主要因素进行优化,建立了胞外多糖产量与各影响因子的回归方程,以及取得模型最优值时各因素的水平。结果表明,干酪乳杆菌FM10-3合成胞外多糖的优化培养条件为:培养温度为34.5℃,培养时间为28.4 h,pH值为6.5;此条件下胞外多糖的产量可达313.36 mg/L,FM10-3的胞外多糖产膜的模型达到显著水平,可以对FM10-3在不同的培养条件下的产糖情况进行分析和预测。     

干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的提取

研究了干酪乳杆菌LC2W胞外多糖的提取工艺,确定提取条件为：沸水浴10min灭酶活,离心除去凝结蛋白和菌体;终质量浓度为40g/L的三氯乙酸除蛋白质;上清液超滤（滤膜MWCO为10ku,压力250kPa,温度25℃）浓缩4倍;终体积分数为75％的乙醇沉淀多糖;热水溶解多糖,透析、冷冻干燥得粗多糖。粗多糖的得率为153．4mg／L。     

干酪乳杆菌胞外多糖诱导小鼠骨髓来源树突细胞成熟以及分泌IL-6、TGF-β和IL-23

为研究干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）胞外多糖（exopolysaccharide,EPS）促进体外培养的小鼠未成熟骨髓来源树突细胞（bone marrow-derived dendritic cells,BMDCs）成熟的作用,分析不同剂量的EPS对BMDCs分泌细胞因子白细胞介素（interleukin,IL）-6、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）和IL-23的影响,并检测EPS对BMDCs抗原提呈能力的影响。首先从干酪乳杆菌中分离纯化出EPS,并检测EPS的纯度;把从BALB/c小鼠体内分离出的骨髓细胞分化为BMDCs,未成熟BMDCs分别与磷酸盐缓冲液、不同剂量EPS和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）体外培养,采用流式细胞法检测了BMDCs成熟表面标记物MHC II和CD86的表达,酶联免疫吸附检测（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）法分析了IL-6、TGF-β和IL-23的表达量,CCK-8法检测了BMDCs与小鼠脾淋巴细胞的混合培养体系中淋巴细胞的增殖率。结果表明：分离出EPS的纯度约为95%;EPS能够上调BMDCs表面MHC II和CD86的表达量;EPS可以显著促进BMDCs分泌IL-6、TGF-β和IL-23（P＜0.05）,但促进水平低于LPS;EPS可以明显促进BMDCs刺激异基因淋巴细胞的增殖。综上所述,在体外实验中,干酪乳杆菌EPS能够促进BALB/c小鼠BMDCs的成熟,诱导BMDCs分泌与辅助性T17细胞分化和增殖相关的细胞因子IL-6、TGF-β和IL-23,并且可以增强BMDCs的抗原提呈能力。     

乳杆菌胞外多糖抗氧化活性研究

从本实验室保藏的8株产胞外多糖的乳杆菌:干酪乳杆菌-Y3,干酪乳杆菌-Y4,干酪乳杆菌-Y16,植物乳杆菌-Y41,植物乳杆菌-Y42,植物乳杆菌-Y44,干酪乳杆菌-Y35,鼠李糖乳杆菌LGG中,筛选出1株产抗氧化活性多糖的菌株,评价其抗氧化性并分析其结构。采用酸沉醇提法从8株乳杆菌的MRS培养液中提取胞外多糖,并用苯酚硫酸法和考马斯亮蓝法测定粗多糖和蛋白含量,同时测定胞外多糖的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH)清除率、2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS)清除率、羟自由基(·OH)清除率、铁离子还原力(FRAP)、氧自由基吸收能力(ORAC)及对ABAP氧化损伤HT-29细胞的保护作用,以评价8株菌胞外多糖抗氧化活性。通过主成分分析法得到产高抗氧化活性胞外多糖的菌株为Y42。进一步研究发现:随着菌株Y42胞外多糖作用浓度的降低,对ABAP氧化损伤HT-29细胞的保护作用降低,然而都显著高于氧化损伤组(P0.05)。菌株Y42胞外多糖显著上调HT-29细胞过氧化物酶和超氧化物歧化酶的表达量(P0.05),HT-29细胞内谷胱甘肽过氧化物酶活性也显著高于氧化组(P0.05)。菌株Y42胞外多糖由中性多糖和酸性多糖组成,其单糖组成为甘露糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖,它们的物质的量比为11.30∶3.51∶10.64∶7.53∶7.19。红外光谱扫描显示菌株Y42胞外多糖具有典型的特征吸收峰,属于吡喃糖环的骨架模式。     

藏灵菇源干酪乳杆菌KL1胞外多糖抑制人结肠癌细胞增殖的研究

分离纯化藏灵菇源干酪乳杆菌KL1胞外多糖(EPS),研究EPS纯品对HCT-8人结肠癌细胞的增殖抑制和诱导细胞凋亡作用。利用Sepharose CL-6B凝胶柱探讨干酪乳杆菌KL1菌株EPS粗品的纯化条件,应用紫外全波长扫描及苯酚-硫酸法鉴定EPS纯度;采用CCK-8法和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒研究EPS对HCT-8人结肠癌细胞的增殖抑制和凋亡作用。结果表明:在0.02～0.12mol/L磷酸盐缓冲液梯度洗脱、流速3mL/min、样品上样质量浓度15.0mg/mL、样品上样量2.0mL的纯化条件下获得EPSa和EPSb两个单一组分的胞外多糖,其纯度分别为91.67%和82.86%。EPSa处理HCT-8人结肠癌细胞体外实验发现,EPSa对HCT-8细胞的增殖有抑制作用,以及诱导细胞凋亡的发生,且细胞生长抑制率呈时间-剂量依赖性。提示藏灵菇源干酪乳杆菌KL1菌株的EPSa有抑制结肠癌细胞增殖的生物活性。