精氨酸脱亚胺酶的研究进展

精氨酸脱亚胺酶是一种具有重要应用前景的抗肿瘤酶类.结合国内外研究成果,综述了精氨酸脱亚胺酶的抗癌活性、分子结构、化学修饰以及精氨酸脱亚胺酶基因的克隆、表达等研究领域的进展,旨在为精氨酸脱亚胺酶的研究与开发提供借鉴.     

理性设计提高奥氏嗜热盐丝菌精氨酸脱亚胺酶的热稳定性

奥氏嗜热盐丝菌(Halothermothrix orenii)来源的精氨酸脱亚胺酶具有催化精氨酸水解生成瓜氨酸的活性,但其热稳定性有待进一步提升。为此,该研究对此来源的精氨酸脱亚胺酶进行三维结构分析和理性设计,选择了10个单点突变体。通过分子克隆、表达纯化和变性温度(T_m)测定,获得了2个酶活力稍降低但热稳定性提高的突变体T180Y和A190P,有序叠加后获得双点突变体T180Y/A190P,3个突变体的T_m值分别提高了2.5、1.9、5.2℃,相比于野生酶,3个正向突变体在50℃下保温180 min后,残余酶活力分别提高了30%、23%和41.8%。三维结构分析表明表面空穴填充和芳香环作用可能是T180Y热稳定性增强的原因,而A190P推测是由于脯氨酸的吡咯环刚性结构以及与空间相邻残基之间的疏水相互作用增强了其热稳定性。随后,将突变体应用于瓜氨酸的生产,双点突变体T180Y/A190P的生产速率和瓜氨酸产量均高于野生型。该研究为其他工业酶的理性设计提供了一定参考依据。     

粪肠球菌SK32.001精氨酸脱亚胺酶的分离纯化及酶学性质研究

对Enterococcus faecalis SK32.001所产的精氨酸脱亚胺酶（ADI）进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。实验结果表明,通过细胞破碎,硫酸铵沉淀,Hi Prep Q FF 16/10阴离子交换层析,Sephadex G-75等纯化方法获得电泳纯精氨酸脱亚胺酶,分子量约为42ku,催化最适温度和p H分别为50℃和6.5,在30⁴0℃和p H5.5⁷.5时较稳定。不同浓度的Zn2+对酶活性影响较大。1mmol/L的Zn2+和10mmol/L的Co2+、Ca2+、Mg2+对酶活有较大的促进作用,10mmol/L的Cu2+对酶的抑制作用最强。精氨酸脱亚胺酶在最适反应条件测定其米氏常数为1.33mmol/L,最大反应速度为2.41μmol/min。      

精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

通过PCR扩增得到菌株编码ADI的arcA基因,并构建表达载体pET24a-ADI。将该载体导入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达ADI基因的重组菌。对ADI诱导表达条件进行优化,结果发现宿主菌在A600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在30℃诱导4 h酶活最高,为2.04 U/mL发酵液。经超声波破碎、HiPrep DEAE FF阴离子交换层析、SuperdexTM200凝胶过滤层析,可获得SDS-PAGE电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)。rADI相对分子质量大小为92 600,由两个相同亚基组成,纯化后的rADI比酶活达20.9 U/mg。     

恶臭假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶发酵条件及特性的研究

对恶臭假单胞菌N0705产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件及部分酶学性质进行了研究.结果表明,在培养温度28℃,培养基初始pH值为6.6,接种量4%,装液量40mL/250mL,发酵时间50h时,精氨酸脱亚胺酶酶活最大.精氨酸脱亚胺酶发酵粗酶液在温度37℃及pH 6.0～7.0时有较好的稳定性.     

固定化脂肪酶的制备及其酶学性质的研究

以大孔树脂为载体进行脂肪酶的固定化,通过优化固定化条件得到高活性固定化脂肪酶并对其酶学性质进行研究。结果表明:弱碱性大孔阴离子交换树脂D301R是最佳的固定化载体;最优固定化条件为加酶量10%(以大孔树脂质量计),加水量30%(以大孔树脂质量计),4℃下在异辛烷中固定5 h。与游离脂肪酶相比,固定化脂肪酶具有良好的热稳定性、储存稳定性、吸附稳定性和对有机溶剂的抗逆性,循环使用6次,水解橄榄油的酶活回收率仍可达到50%。     

乳酸足球菌精氨酸代谢与瓜氨酸积累

酿造酱油中氨基甲酸乙酯的主要前体物质瓜氨酸由乳酸足球菌通过精氨酸代谢产生。为了研究酱油中瓜氨酸的积累机制,以分离自酱油成曲的乳酸足球菌Pediococcus acidilactici BBE1120为研究对象,考察不同培养条件(碳源、盐浓度、氨基酸)对其积累瓜氨酸的影响。结果表明,高盐环境是导致乳酸足球菌积累瓜氨酸的关键因素,碳源的种类及浓度对瓜氨酸的积累也有一定影响,培养基中精氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸含量对瓜氨酸的积累影响不大。该研究结果对阐明酱油发酵过程中氨基甲酸乙酯前体物质的积累机制具有重要意义。     

漆酶固定化及其性质研究

本文就漆酶的固定化及固定化酶的性质作了初步研究。利用明胶和海藻酸钠的聚合作用与海藻酸钙凝胶球的包埋作用制备固定化漆酶．结果表明：固定化酶米氏常数Km为12.0mg／ml，游离酶米氏常数Km为7．0mg／ml，固定化酶最适温度为40℃，游离酶为30℃．同时固定化酶明显提高了游离酶的耐热性、储藏稳定性和操作稳定性。     

明胶固定化果胶酶的制备及酶学性质研究

以明胶为载体、戊二醛作为交联剂制备固定化果胶酶，对其固定化条件和酶学性质进行了研究。结果表明：以15％明胶为载体、5％戊二醛为交联剂、1g明胶固定果胶酶4mg制备的固定化酶，其酶活力回收率达45．85％：固定化酶的最适温度55℃，最适pH3．4，Km^app值3．48mg／ml；固定化酶的酸碱稳定性与温度稳定性均得到提高，连续使用7次后固定化酶相对活力还剩下47．06％。     

漆酶固定化及其性质研究

本文就漆酶的固定化及固定化酶的性质作了初步研究。利用明胶和海藻酸钠的聚合作用与海藻酸钙凝胶球的包埋作用制备固定化漆酶。结果表明固定化酶米氏常数Km为12.0mg/ml,游离酶米氏常数Km为7.0mg/ml,固定化酶最适温度为40,游离酶为30,同时固定化酶明显提高了游离酶的耐热性、储藏稳定性和操作稳定性。     

几丁质脱乙酰酶MCDA01的固定化及应用研究

应用海藻酸钠包埋法优化几丁质脱乙酰酶的固定化条件,提高几丁质脱乙酰酶稳定性.通过测定海藻酸钠浓度、CaCl2浓度、硬化时间、戊二醛体积分数和交联时间对固定化几丁质脱乙酰酶的活性影响,选取对固定化效果影响显著的因素,进行响应面试验优化,并分析固定化酶的热稳定性和pH值稳定性.最佳优化条件:2.09mg/mL海藻酸钠,3....     

固定化谷氨酰胺酶及其性质的研究

采用聚乙烯醇,将黑曲霉AS3350菌丝体用包埋法固定化,经活化与诱导,其酶活力远高于游离细胞,固定化酶的作用最适温度为37℃,耐热性比游离细胞提高,活化的最适温度为30℃,pH7.0—7.5,时间为45hr,并探讨了其耐盐性。     

交联酶聚集体法制备单宁酶及固定化酶性质研究

交联酶聚集体法(cross-linked enzyme aggregates,CLEAs)是一种新型的无载体酶固定化方法。使用该法固定化黑曲霉产单宁酶,制备无载体固定化单宁酶(Cross-linkedenzyme aggregates-tannase,CLEAs-TA),并对其制备条件、结构特征、酶学性质进行分析。结果表明,最优制备条件为单宁酶游离粗酶液在冰水浴中经80%的硫酸铵沉淀30min后,以1.5%戊二醛水溶液进行酶聚集体交联反应,可获得较高活性、较高稳定性的交联酶聚集体,酶活回收率达47.33%,对酯键水解作用的最适温度、最适pH值分别为50℃、4.5,与游离酶相比,表现更高的pH及温度稳定性,重复使用6次后,活力剩余32.86%,其良好的操作稳定性有利于没食子酸丙酯高效转化为没食子酸及广泛应用于水解茶饮料中单宁的反应。     

海藻酸钠固定化碱性蛋白酶制备及酶学性质的研究

对采用海藻酸钠固定化碱性蛋白酶的方法和酶学性质进行了研究。在单因素实验基础上,采用响应面优化方法确定固定化的最优条件,得到的最佳条件为:海藻酸钠浓度3.1%,pH9.4,CaCl2浓度3.0%,游离酶添加量10000U/g,时间1.8h,固定化酶活力可达5518U/g。固定化酶的最适pH为10,最适温度为60℃,制得的固定化酶的热力学稳定性和操作稳定性较好。此外,固定化酶重复利用5个循环后酶活力仅降低40%。     

可溶性固定化胰蛋白酶的制备及性质研究

将胰蛋白酶偶联在亲水性高分子聚合物N-琥珀酰壳聚糖上,制备得到水溶性固定化胰蛋白酶,并对其部分酶学性质进行了研究。结果表明,可溶性固定化胰蛋白酶的最适pH为9·0,最适温度为60℃,Km值为0·28mg/mL;该酶在pH6·0以上能够完全溶解,在pH4·0左右基本不能溶解;可溶性固定化胰蛋白酶在60℃条件下,保温8h,仍有55%的活性;在4℃条件下,30d后活性保留达98%;在4℃下保存72h,活性没有明显降低。pH8·0~10·0稳定性最好(相对活性>90%)。     

AB-8大孔树脂固定化溶菌酶及酶学性质研究

利用AB-8大孔树脂为载体,戊二醛为交联剂对溶菌酶进行固定化,研究固定化酶的制备条件、酶学性质、微观结构及抑菌效果。结果表明：固定化时间4h、固定化温度25℃、戊二醛质量浓度0.3g/100mL、m酶:m载体＝1:200时固定化溶菌酶的相对酶活力最高;与游离酶相比,溶菌酶经过固定化后耐热性提高、耐酸性增强,米氏方程分析表明,溶菌酶经过固定化后与底物壳聚糖的亲和力下降,固定化酶重复使用5次时,酶活力残留率为57.6%,抑菌实验结果表明,固定化溶菌酶对纯牛奶具有较好的抑菌效果。     

金针菇漆酶的固定化及其性质研究

采用海藻酸钠包埋法制备固定化漆酶,结果表明,固定化pH值为4.5,海藻酸钠与CaCl2质量浓度均为2％,酶液与海藻酸钠体积比为1∶1时,漆酶的固定化效果最佳,酶活回收率为48.6％.固定化酶的最适pH值为3.0,最适温度为40℃,米氏常数Km为21.5μmol/L,游离酶的最适pH值为3.0,最适温度为30℃,米氏常数Km为18.6μmol/L,与游离酶相比,固定化漆酶的热稳定性有明显提高,耐酸性略有增加,最适反应温度提高了10℃.     

高性能淀粉基酶固定化载体的制备研究

本实验采用生物酶法对淀粉进行处理,然后再用高碘酸钠对酶处理淀粉进行氧化,制备出了高性能的淀粉基酶固定化载体.对淀粉水解率、反应时间、温度、pH、高碘酸钠的浓度和高碘酸钠和淀粉的摩尔比等对载体性能的影响进行了研究.制备出的载体具有较强的吸附性能和大量的醛基,对酶具有较强的固定化能力.     

游离果胶酶和固定化果胶酶的酶学性质

研究游离果胶酶和固定化果胶酶的酶学性质,结果表明,游离酶的最适温度为55℃,最适pH为4.0,明胶固定化酶的最适温度为60℃,最适pH为3.5,固定化酶的稳定性比游离酶更好,底物与固定化酶的亲和力增强。     

转氨酶的固定化及酶学性质研究

利用环氧树脂载体进行固定化转氨酶的研究,通过单因素优化确定了较优的酶固定化条件:ES-103b树脂载体、转氨酶和辅酶磷酸吡哆醛最佳质量比为50:6:5,在pH为7.0的1mol/L磷酸钾缓冲液介质中吸附25 h.将得到的固定化颗粒重新置于pH为9.0的100 mmol/L磷酸钾缓冲液中,30℃保温30 h.取出后置于pH为8.5的3 mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液中,25 ℃保温12h,制得固定化转氨酶,其比活力为52.7 U/g(湿载体),酶活回收率达到49.3％.酶学性质研究表明:固定化转氨酶催化反应最适pH、温度分别为7.0、50℃;固定化酶热稳定性及pH稳定性明显提高,50℃条件下的半衰期为20.2 d;在pH 8.0的三乙醇胺缓冲液中(4℃),10 d后酶活仍保持初始酶活的82.3％.