人源化抗CD20单克隆抗体的理化性质及结晶条件的筛选

目的分析人源化抗CD20单克隆抗体的理化性质,并初步筛选其结晶条件。方法分别采用还原、非还原SDS-PAGE及高效液相体积排阻色谱(size exclusive chromatography-HPLC,SEC-HPLC)法检测抗体纯度;还原SDSPAGE测定抗体轻重链相对分子质量;毛细管电泳测定抗体等电点;高效液相阳离子交换色谱(ion exchange chromatographyHPLC,IEC-HPLC)法检测抗体电荷异质体含量;悬滴气相扩散法初步筛选抗体的结晶条件。结果人源化抗CD20单克隆抗体的非还原SDS-PAGE纯度为100%,还原SDS-PAGE纯度(轻链+重链)为100%,重链、轻链相对分子质量分别为58 000和27 000,SFC-HPLC纯度为99.2%;等电点为9.2;抗体表面电荷分布较均一;得到的蛋白晶体为孪晶,分辨率约为8埃。结论该抗体的纯度达到结晶要求,以其理化性质为基础,初步筛选出了结晶条件,为其结构和功能的研究奠定了基础。     

重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的质控方法及质量标准的建立

目的建立重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体(rhRMcAb)的质控方法和质量标准。方法采用小鼠中和试验(MNT)和快速荧光灶抑制试验(RFFIT)分别测定6批rhRMcAb样品的中和活性;还原、非还原SDS-PAGE检测rhRMcAb样品的纯度;还原烷基化胰蛋白酶酶切和反相高效液相色谱法分析rhRMcAb的肽图;焦谷氨酸肽酶去除N-端焦谷氨酸封闭后,氨基酸序列分析仪测定rhRMcAb的N-端氨基酸序列;表面等离子共振法(Surface plasmon resonance,SPR)测定rhRMcAb与狂犬病病毒糖蛋白的亲和常数;按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhRMcAb的各项其他指标,并建立其质量标准。结果采用MNT和RFFIT2种方法检测6批rhRMcAb的中和活性,批间活性基本一致;3批rhRMcAb原液的还原SDS-PAGE纯度大于99.0%,非还原SDS-PAGE除抗体主带外,在高、低相对分子质量处分别存在一些次带;3批原液样品的肽图图谱与理化测定对照品一致;N-端氨基酸序列与理论序列一致;结合狂犬病病毒糖蛋白抗原的亲和常数为1.86×108/M;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求;建立的质量标准中,中和活性应不低于500IU/mg,SDS-PAGE及HPLC纯度应不低于98.0%。结论已建立了rhRMcAb的质控方法和质量标准,可用于rhRMcAb产品的检定。     

重组抗体的N-端氨基酸序列测定

目的建立具有焦谷氨酸封闭N-端的重组抗体N-端氨基酸序列分析方法。方法利用高温稳定的焦谷氨酸肽酶,在重组人源抗狂犬病病毒单抗样品高温变性条件下,去除其N-端焦谷氨酸封闭。经还原SDS-PAGE和电印迹后,进行N-端氨基酸序列测定,并与电印迹后在PVDF膜上去封闭处理效果进行比较。结果用该方法去封闭后的抗体样品N-端焦谷氨酸去除效果较好,可顺利进行N-端氨基酸序列测定;而电印迹后在PVDF膜上去封闭处理,N-端焦谷氨酸不能充分去除,无法进行N-端氨基酸序列测定。结论该方法适于具有焦谷氨酸封闭N-端的单抗的N-端氨基酸序列分析。     

人源化叶酸受体α抗体质控方法的建立

目的建立人源化叶酸受体α抗体的质控方法。方法应用基于表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术的BIAcore3000系统测定人源化叶酸受体α单抗与重组人叶酸受体α的亲和力,从而反映该抗体的功能;采用ELISA法测定其抗原结合力;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定其纯度;紫外分光光度法测定其蛋白含量;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;其他各项指标检测按《中国药典》三部(2005版)要求进行。结果人源化叶酸受体α单抗成品的平均相对百分效价为105%,RSD为6.0%。单抗成品及参考品与叶酸受体的结合力均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,其曲线相关系数在0.98以上,成品经3次测定,相对抗原结合力平均值为97%,RSD为25%。还原SDS-PAGE分析显示,单抗成品的IgG重链和轻链百分比为98.2%;非还原SDS-PAGE分析显示,完整IgG百分比为96.7%;SEC-HPLC分析显示,单抗成品单体为99.1%,聚合体为0.9%。其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论已初步建立了人源化叶酸受体α抗体的质控方法,为该制品的质量控制奠定了基础。     

EDTA在重组Fc融合蛋白纯化工艺中的作用

为了研究EDTA在FGF21-L-Fc融合蛋白纯化工艺中的作用,将样品以是否添加EDTA及其添加方式分为3组,选用阴离子交换介质Q Sepharose Fast Flow和分子筛介质Superdex 200层析技术纯化了3组蛋白,使用非还原非变性SDS-PAGE、SEC-HPLC以及RP-HPLC分析和检测三组蛋白的纯度。研究发现,含EDTA缓冲液组、添加EDTA干粉组和无EDTA组的非还原非变性SDS-PAGE的纯度分别为99.61%、99.02%和98.90%;SEC-HPLC纯度分别为99.39%、99.00%和98.53%;RP-HPLC纯度分别为99.01%、98.83%和97.51%。结果表明,在FGF21-L-Fc融合蛋白纯化过程中添加EDTA在保持蛋白质稳定性的基础上能提高其纯度。     

卵巢癌相关抗原CA125单克隆抗体的制备

目的制备卵巢癌相关抗原CA125R单克隆抗体,并进行鉴定。方法将CA125一段串联重复序列(CA125R)基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组表达质粒pGEX-CA125R,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-CA125R融合蛋白。表达的融合蛋白经GST亲和层析柱纯化后,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备CA125单克隆抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性,单克隆抗体亚类测定试剂盒分析单抗的亚类。腹水诱生法大量制备单抗,SDS-PAGE分析单抗的纯度,间接ELISA法检测单抗的效价。结果重组原核表达质粒pGEX-CA125R经双酶切及测序,证实构建正确;纯化的GST-CA125R融合蛋白相对分子质量约44 000,纯度约为95%,可与小鼠抗GST单克隆抗体发生特异性反应;获得1株可稳定分泌抗CA125单克隆抗体的杂交瘤细胞株3-B2,其分泌的单抗能特异识别GST-CA125R融合蛋白和天然CA125糖蛋白,其抗体亚型为IgG2a型;纯化的腹水单抗纯度约为90%,效价达1×106以上。结论成功获得1株能特异性识别天然CA125糖蛋白的单克隆抗体细胞株,并经腹水诱生法大量制备了抗体,为CA125临床检测试剂盒的研发奠定了基础。     

减少重组蛋白TP25在Protein L层析中形成多聚体方法的建立

目的建立减少重组蛋白TP25在Protein L层析中形成多聚体的方法。方法通过在Protein L层析纯化重组蛋白TP25使用的洗脱缓冲液中添加半胱氨酸(L-cysteine,Cys)等保护剂,并采用碱性溶液中和洗脱液的方法优化多聚体去除条件,经非还原SDS-PAGE检测纯化过程中目的蛋白多聚体的变化情况,葡聚糖凝胶Sephadex G25层析去除洗脱液中Cys。结果去除Protein L层析形成多聚体的最适条件为:用含Cys终浓度为100 mmol/L的20 mmol/L柠檬酸溶液进行直接洗脱,并经0. 5 mmol/L的NaOH溶液中和。该条件下纯化的目的蛋白纯度可达95%以上,且多聚体含量大幅减少。葡聚糖凝胶Sephadex G25可有效去除半胱氨酸。结论在洗脱液中添加Cys可有效减少重组蛋白TP25在Protein L层析纯化过程中多聚体的形成。     

毛细管电泳法测定重组人源化IgG2抗体的纯度

目的建立利用毛细管电泳法测定重组人源化免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)纯度的方法,并进行优化和验证。方法采用单因素法,对稀释液、碘乙酰胺浓度(非还原条件)、加热方式、进样电压、进样时间、分离电压、样品盘和卡盒温度进行多水平优化,并利用优化的方法测定IgG2的纯度。以峰面积对样品加样量进行线性回归,确定该方法的线性范围,并对该方法进行精密度、准确度及溶液稳定性验证。结果最佳电泳条件为:选用超纯水作为稀释液,250 mmol/L碘乙酰胺(非还原条件),70℃干热10 min,进样电压为5 kV,进样时间为30 s,分离电压为15 kV,样品盘和卡盒温度为20℃。在优化的色谱条件下,在还原条件下,IgG2纯度检测的线性范围为50~150μg,相关系数为0.998,重复性的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.14%,中间精密度的RSD为0.24%,且20℃放置13 h稳定;在非还原条件下,IgG2纯度检测的线性范围为50~150μg,相关系数为0.999,重复性的RSD为0.36%,中间精密度的RSD为0.16%,且20℃放置13 h稳定。结论该方法线性关系良好,且精密度、准确度、灵敏度较高,测定结果稳定可靠,适用于重组人源化IgG2的纯度分析。     

幽门螺杆菌重组VacA蛋黄抗体的制备

目的研制高效价、高特异性的抗细胞空泡毒素VacA的鸡蛋黄抗体(IgY),为研制幽门螺杆菌(H.pylori)治疗性抗体奠定基础。方法用纯化的重组细胞空泡毒素抗原免疫22周龄洛曼产蛋母鸡,取免后所产鸡蛋,将蛋黄稀释、离心,收集上清,加硫酸铵沉淀。以ELISA间接法检测抗体效价,Bradford法检测蛋白含量,SDS-PAGE法检测相对分子质量及纯度。结果母鸡初次免疫后76d,抗体效价达到1∶6400,最高可达1∶12800。蛋黄抗体经纯化浓缩后,用SDS-PAGE分析,出现2条蛋白带,纯度可达80%以上,其含量为25·66mg/ml。结论已成功制备了抗重组细胞空泡毒素的特异性蛋黄抗体。     

人α_1型基因工程干扰素单克隆抗体及亲和层析柱的研制

应用杂交瘤技术建立了稳定分泌抗rHu-IFN-α_1的单克隆抗体细胞系,体外连续传代8个月以上,在BALB/c鼠体内连续传代6个月以上,分泌抗体能力不变,特异性专一。11D_2单抗为IgG_2b,17D_9单抗为IgG_1。采用不同方法提纯抗体均得到90％纯度。11D_2单抗中和效价为1024,17D_9单抗为65534。制备亲和层析柱的最佳抗体浓度为5mg/ml,凝胶与抗体体积比为1:2,偶联率均达到95％～98％。11D_2单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1干扰素不易被洗脱,不适宜制备亲和层析柱。17D_9单抗亲和层析柱提纯粗制rHu-IFN-α_1结合的抗原容易被洗脱,适宜制备亲和层析柱。粗制rHu-IFN-α_1经17D_9单抗层析柱后,获得了电泳纯级制品,比原纯度增加15倍,平均收率93％,比活性平均值为6.5×10~6IU/mg。残余鼠IgG量符合规程要求。     

pH值对重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体稳定性的影响

目的研究pH值对重组人源抗狂犬病病毒单克隆抗体NM57稳定性的影响。方法将NM57原液的pH值分别调节为4.0、5.0、6.0、7.0和8.0,分别置于4和40℃保存,于0、2、4、6周取样,观察其外观的变化,并检测其SDS-PAGE及SEC-HPLC纯度。中试规模制备NM57制剂(200IU/ml,pH6.0),4℃放置3、6、9、12、18和24个月,取样观察其外观的变化,SEC-HPLC检测样品纯度,快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测样品中和活性。结果在观察期内,所有样品的外观均保持澄清透明。不同pH值的NM57原液4℃放置6周,纯度无明显变化;40℃放置的不同pH值的NM57原液样品纯度变化有明显差异,NM57(5.0)和NM57(6.0)样品相对稳定。中试规模制备的6批NM57制剂4℃放置24个月,其纯度及中和活性均保持稳定。结论NM57原液在甘氨酸-组氨酸缓冲系统中,pH6.0条件下比较稳定,NM57(pH6.0)制剂长期稳定性良好。     

人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体质控方法的建立

目的建立人源化抗表皮生长因子受体(Epithelial growth factor receptor,EGFR)单克隆抗体的质控方法。方法采用体外细胞生长抑制试验测定人源化抗EGFR单抗的生物学活性;质谱法和还原型SDS-PAGE法测定其准确相对分子质量;去封闭后用Edman降解法测定其N-末端氨基酸序列;SDS-PAGE和分子排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)法测定其纯度;反向液相色谱(RP-HPLC)法测定其肽图;定量PCR法和狭缝杂交法测定其外源性DNA残留量;其余项目按《中国药典》三部(2010版)要求进行。结果人源化抗EGFR单抗原液和成品的相对生物学活性分别为(100±20)%和(94±14)%;质谱法测得该单抗参考品轻、重链的相对分子质量分别为23 370.75和50 341.00,相对误差分别为0.005%和0.006%;还原型SDS-PAGE测得该单抗轻、重链的相对分子质量为27 000和53 400;轻、重链N-末端氨基酸序列均与理论一致;单抗原液的还原型SDS-PAGE纯度为98.5%;SEC-HPLC原液纯度为(98.39±0.05)%和成品SEC-HPLC纯度为(98.17±0.04)%;肽图图谱与理化参考品一致;定量PCR测得其外源DNA残留量小于100 pg/剂量;其他各项指标均符合《中国药典》三部(2010版)要求及其他相关要求。结论初步建立了人源化抗表皮生长因子受体单克隆抗体的质控方法,可用于该制品的常规质量控制。     

鼠抗人间变性淋巴瘤激酶单抗及其试剂盒的制备及鉴定

目的 制备并鉴定鼠抗人间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)单抗及其试剂盒.方法 以人ALK重组蛋白免疫BALB/c小鼠,常规杂交瘤技术制备人ALK单抗,ELISA及免疫细胞化学(immunocytochemical,ICC)法筛选稳定分泌ALK 单抗的杂交瘤细胞株;SDS-P...     

人α_1型干扰素单克隆抗体在纯化人α_1型基因工程干扰素的应用

作者采用本所研制的人α_1型干扰素单克隆抗体,将人α_1型基因工程干扰素纯化至电泳纯级,平均得率为93％,平均比活性为6.5×10~6 IU/mg蛋白,平均提纯倍数为15倍。3次试验经SDS-PAGF银染色法测定,均呈一条带,在非还原电泳条件下扫描干扰素纯度均在100％,残余鼠IgG含量测定均合乎规程要求,证明人α_1型单克隆抗体用于纯化人α_1型基因工程干扰素效果良好。     

戊型肝炎病毒重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒的制备

目的制备戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)重组蛋白P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒。方法以4型HEV ORF2重组蛋白P179免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,有限稀释法进行克隆化培养,制备腹水,并对杂交瘤细胞进行染色体计数,鉴定单抗亚类及特异性、并检测稳定性;经SDS-PAGE分析抗体纯度,以兔抗179抗原多抗作为包被抗体,HRP标记P179单抗作为酶标抗体,建立双抗体夹心ELISA法,制备试剂盒,并进行最佳线性范围测定、准确性、精密性和稳定性验证。结果获得4株能稳定分泌抗P179抗原单抗的杂交瘤细胞株,分别命名为3A10、3F8、4E9和5G6,腹水抗体效价分别为1∶10-7、1∶10-6、1∶10-6和1∶10-7,染色体数分别为96、98、101和99条;亚类分别为IgG2a、IgG2a、IgG1和IgG2b;4株单抗连续传代3个月,液氮冻存1年抗体效价未发生变化;制备的试剂盒有良好的线性(R2>0.950 0)、准确性、精密性,试验内变异系数为4.17%～6.26%,回收率在87.9%～114.8%之间,试验间变异系数为5.82%～8.01%,回收率在90.8%～108.9%之间;于37℃及4℃放置3 d,仍具有良好的稳定性。结论成功制备了戊型肝炎病毒P179抗原单克隆抗体及抗原检测试剂盒,可用于戊型肝炎疫苗生产中定量检测疫苗抗原。     

大规模提取体内治疗用单克隆抗体的工艺

用两步法从WuT3细胞培养上清中提取WuT3单克隆抗体（McAb）,首先将培养上清直接上SP离子交换柱,再上DEAE柱,获取提纯的McAb。该工艺的确定及放大均在Pharmacia产Biopilot中试纯化系统上进行。一次投料20L,纯化规模达2g,纯化的McAb经SDS－PAGE测定,纯度基本达到95％,免疫荧光活性为66±9％。热原质合格,支原体、残余DNA均为阴性,达到体内制剂质控要求。     

应用免疫印迹法检测基因工程人白细胞介素-2的特异性

基因工程人白细胞介素-2(rIL-2)样品首先经垂直SDS-PAGE按其分子量大小分开,再经电转移仪转到硝化纤维膜上,用小牛血清或牛血清白蛋白封闭空余位点后,加入鼠抗人卫IL-2单克隆抗体(DMS-1),室温作用1.5小时后洗膜,加入兔抗BALB/c鼠IgG-HRP,作用后加入二氨基联苯胺显色,以显色带的位置和带数来判断制品的特异性和纯度。我们的产品经显色后只见一条带,分子量为1.5万,未见多聚体,达到免疫纯。     

牛心肌肌钙蛋白T的提取、纯化及其单克隆抗体的制备

目的提取、纯化牛心肌肌钙蛋白T(Cardiac troponin T,cTnT),并制备其单克隆抗体。方法采用组织匀浆、蛋白层析技术提取、纯化牛cTnT,紫外分光光度法检测其浓度;SDS-PAGE检测其纯度;间接ELISA法检测其反应特性。将纯化的牛cTnT免疫小鼠,进行细胞融合,间接ELSIA法筛选阳性杂交瘤细胞株,采用小鼠体内法制备腹水。结果纯化的两批牛cTnT浓度分别为0.246和0.336 mg/ml;相对分子质量约为37 000,纯度分别为86.02%和93.77%;纯化的cTnT蛋白可与鼠抗牛cT-nT单克隆抗体结合。共获得5株分泌抗牛cTnT单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,阳性杂交瘤细胞株3B10腹水抗体效价达1∶10 240。结论已成功提取、纯化了牛cTnT,并建立了稳定分泌抗牛cTnT单抗的杂交瘤细胞株,为cTnT检测试剂盒的国产化奠定了基础。     

表达人源化抗血管内皮生长因子单克隆抗体的重组CHO细胞传代稳定性评价

目的评价表达人源化抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)单克隆抗体(简称抗VEGF单抗)的重组CHO细胞(K11细胞)传代稳定性。方法细胞培养瓶中进行K11细胞连续传代,于培养1、4和7个月时测定K11细胞的倍增时间、单细胞抗体表达量和基因拷贝数。在传代培养过程中,分别于传代培养2、3、4、5和7个月时将K11细胞接种至全自动生物反应器中进行发酵培养,测定发酵培养产物的单抗表达量,测序单抗轻、重链基因;采用三步层析(亲和、阴/阳离子交换层析)纯化人源化抗VEGF单抗,分析人源化抗VEGF单抗的纯度、电荷异质性、一级结构和生物学活性。结果 K11细胞在细胞培养瓶中连续传代培养1、4和7个月时,对数生长期K11细胞的倍增时间分别为25、23和34 h,单细胞抗体表达量分别为15. 6、15. 0和11. 5 pg/(个·d),单细胞基因拷贝数分别为200、219和204 copies/个。生物反应器发酵培养5批单抗,纯化后单抗表达量为1. 18~2. 06 g/L,K11细胞单抗轻、重链基因测序结果均与理论序列一致,人源化抗VEGF单抗SEC-HPLC单体纯度为96. 23%~98. 21%,电荷异质性和一级结构相似,生物学活性为(0. 859~0. 901)×10^4U/mg。结论 K11细胞在工业化生产规模的培养周期内保持稳定,可满足人源化抗VEGF单抗的商品化的生产需要。