重组人β-神经生长因子在昆虫细胞中的表达、纯化及其生物学活性

目的在昆虫细胞中表达重组人β-神经生长因子(Recombinant humanβnerve growth factor,rhβ-NGF),并对表达产物进行纯化和生物学活性鉴定。方法构建rhβ-NGF杆状病毒表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF],利用脂质体cellfectionⅡ将质粒转染至昆虫细胞Sf9中,用转染细胞的上清反复感染Sf9细胞,大量收获含目的蛋白的培养上清,利用离子交换层析和分子筛层析纯化rhβ-NGF,纯化产物经SDS-PAGE和Western blot分析,并通过鸡胚背根神经节培养法检测rhβ-NGF的生物学活性。结果重组表达质粒Bacmid+[rhβ-NGF]经测序证实构建正确;重组病毒感染的Sf9细胞可表达rhβ-NGF;纯化的rhβ-NGF蛋白经SDS-PAGE分析,可见相对分子质量约14 200的单一条带,纯度大于98%,能与兔抗人NGF单克隆抗体特异性结合,并能刺激神经节突起生长,其比活性约为600 000 AU/mg。结论成功在昆虫细胞中表达了有生物学活性的rhβ-NGF,为其大量制备奠定了基础。     

杆状病毒AcMNPV包膜蛋白GP64胞外区的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的原核表达、纯化苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)包膜糖蛋白GP64胞外区,并制备多克隆抗体。方法根据GenBank中登录的AcMNPV GP64基因全长序列,采用DNAStar软件设计去除GP64基因信号肽和跨膜区的引物,PCR扩增GP64胞外区基因,插入原核表达载体pET-21b(+)中,转化大肠埃希菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经His Trap FF crude纯化后,进行SDS-PAGE和Wester blot分析。将纯化的重组蛋白经背部皮下免疫家兔,制备多克隆抗体,采用免疫染色法检测多克隆抗体对AcMNPV的中和作用。结果重组表达质粒pET-21b(+)-GP64经双酶切及测序证实构建正确;表达的重组蛋白相对分子质量约为52 000,表达量占菌体总蛋白的46.8%,主要以包涵体形式表达;纯化的重组蛋白纯度可达95%以上,可与鼠抗AcMNPV GP64蛋白单克隆抗体特异性结合;制备的兔抗GP64蛋白多克隆抗体能与纯化的重组蛋白和杆状病毒发生特异性反应,抗体效价高于1∶1 000 000,其可中和100 TCID50/ml的AcMNPV,使AcMNPV无法感染昆虫细胞Sf9,中和效价为1∶8。结论成功原核表达了AcMNPV GP64蛋白胞外区,并制备了对AcMNPV有完全中和能力的多克隆抗体,为昆虫细胞/杆状病毒表达系统的应用研究及杆状病毒毒株的检定等提供了材料。     

Sf9昆虫细胞宿主蛋白含量双抗体夹心ELISA检测方法的建立

目的建立Sf9昆虫细胞宿主蛋白(host cell protein,HCP)含量双抗体夹心ELISA检测方法。方法从Sf9昆虫细胞中提取总蛋白,免疫家兔,制备兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体,经辛酸-硫酸铵沉淀和CL-4B层析柱纯化后,采用SDS-PAGE分析抗体纯度,间接ELISA法检测抗体效价,Western blot法检测抗体特异性;用纯化的多克隆抗体作为包被抗体,采用改良过碘酸钠法将HRP酶标记至纯化的抗体上作为酶标抗体,采用方阵滴定法确定双抗体夹心ELISA方法的最适工作条件。确定该方法的最佳线性范围及最低检测限,验证该方法的准确度及精密度。将表达戊型肝炎ORF2基因的重组杆状病毒感染Sf9细胞,收获病毒培养上清,制备3批纯化的重组蛋白,用建立的方法检测纯化过程中HCP含量的变化,验证其在纯化工艺中的适用性。与商品化试剂盒进行比较,检测两种方法的灵敏度及在制品中的适用性。结果纯化后的兔抗Sf9细胞总蛋白多克隆抗体纯度达90%以上,抗体效价为1∶10 000,可与Sf9细胞蛋白特异性结合。建立的双抗体夹心法ELSA方法最佳抗体包被浓度为20μg/ml,37℃孵育1 h;酶标抗体的工作浓度为1∶200,37℃孵育1 h;TMB室温显色30 min;测定各孔A450值。该方法的最佳线性范围为50~1 600 ng/ml,最低检测为50 ng/ml;不同浓度的Sf9细胞蛋白抗原回收率在87.8%~117%之间,变异系数均小于10%;制备的3批重组蛋白经超滤及层析纯化后,HCP含量均逐渐降低至小于50 ng/ml,纯化工艺可有效去除HCP;与商品化试剂盒比较,该方法更适用于检测戊肝类病毒颗粒样品。结论已成功建立Sf9昆虫细胞残余蛋白含量检测的双抗体夹心法ELSA方法,可用于检测Sf9昆虫细胞/杆状病毒表达系统纯化的重组蛋白中HCP含量。     

牛副流感病毒3型血凝素-神经氨酸酶蛋白在杆状病毒中的表达

目的在杆状病毒中表达牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type-3,BPIV-3)血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutinin-neuraminidase,HN)。方法提取BPIV-3 BN-1株RNA,设计特异性引物扩增HN全长ORF,将其克隆至杆状病毒供体载体p Fast Bac HTA中,获得重组供体质粒p Fast Bac-HN。将p Fast Bac-HN转化至感受态细胞E.coli DH10Bac,制备穿梭质粒Bacmid-HN。将纯化的Bacmid-HN经脂质体转染至Sf21昆虫细胞,拯救重组杆状病毒,并进行Western blot鉴定。结果经PCR及测序鉴定证明,HN基因重组供体质粒p Fast Bac-HN及穿梭质粒Bacmid-HN构建正确。利用Sf21昆虫细胞成功拯救重组杆状病毒,连续传代扩增3代的病毒滴度为2×108 CPE/ml。重组HN蛋白的相对分子质量约70 000,可与BPIV-3阳性血清发生特异性反应。结论在杆状病毒表达系统中成功表达了BPIV-3重组HN蛋白,为BPIV-3的诊断及疫苗效力评价奠定了基础。     

人MCIR基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MCIR基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MCIR为模板，利用PCR方法扩增人MCIR基因，将MCIR基因连接到pfastBacl质粒上，与穿梭载体DH10Bac转座，获得Bacmid-MCIR质粒后，通过脂质体介导，转染Sf9细胞，使其表达重组杆状病毒，经SDS-PAGE检测表达产物，放射受体分析法检测目的蛋白MCIR活性。结果Bacmid-MCIR质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱，在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和，具有生物学活性。结论MCIR基因成功在真核细胞中得到表达。     

利用细菌／杆状病毒系统昆虫细胞中表达HIV—1Gag蛋白

目的 在昆虫细胞中表达中国流行株B亚型HIV－1Gag蛋白，制备重组Gag蛋白。方法 将中国株B亚型HIV－1的Gag全基因序列，克隆到杆状病毒表达载体pfastbacI中，构建了重组质粒pfastGag。经转座及平板筛选，提取重组穿梭质粒Bacmid。经转染Sf9昆虫细胞后，获得了重组杆状病毒。用SDS－PAGE、Westem blot和间接免疫荧光实验分析的目的的蛋白。结果 重组病毒在昆虫细胞Sf9中高效表达了中国株B株型HIV－1Gag蛋白，表达的重组蛋白具有良好的抗原活性，可与HIV－1标准阳性血清及p24单克隆抗体发生较强的免疫反应。结论 重组表达产物可用于艾滋病的免疫诊断和疫苗研究。     

人MC1R基因在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达

目的利用杆状病毒表达系统进行人恶性黑色素瘤A375细胞MC1R基因在Sf9昆虫细胞中的表达。方法以pMD18-T-MC1R为模板,利用PCR方法扩增人MC1R基因,将MC1R基因连接到pfastBac1质粒上,与穿梭载体DH10Bac转座,获得Bacmid-MC1R质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经SDS-PAGE检测表达产物,放射受体分析法检测目的蛋白MC1R活性。结果Bacmid-MC1R质粒转染Sf9细胞后的SDS-PAGE图谱,在相对分子质量为35000处有一条新生蛋白带。放射受体分析结果显示表达的蛋白与标记配体特异亲和,具有生物学活性。结论MC1R基因成功在真核细胞中得到表达。     

心肌钙蛋白I在杆状病毒表达系统中的表达

目的在杆状病毒表达系统中表达心肌钙蛋白(Icardiac troponin I,cTnI)。方法将带有6×His标签的cTnI基因亚克隆至杆状病毒转移载体pFastBac-dua(lpFBd)中,构建重组转移质粒pFBd-cTnI,转化大肠埃希菌DH10-Bac,筛选获得重组杆粒rbacmid-cTnI,转染昆虫细胞Sf9,SDS-PAGE和Western blot检测转染细胞中cTnI蛋白的表达。结果重组杆粒rbacmid-cTnI经PCR鉴定证明构建正确;重组杆粒rbacmid-cTnI转染的Sf9细胞(Invitrogen细胞株)可表达相对分子质量约25 000的cTnI蛋白条带,表达的cTnI蛋白可被鼠抗His标签单抗和兔抗cTnI多抗特异性识别。结论成功在Sf9细胞中表达了cTnI蛋白,为下一步大规模制备cTnI蛋白以及建立cTnI相关检测方法奠定了基础。     

截短型人乳头瘤病毒58型L1蛋白在昆虫细胞中的表达

目的利用昆虫细胞杆状病毒表达系统构建含截短型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)58型主要衣壳蛋白L1基因的重组杆状病毒,并在Sf9细胞中表达。方法从NCBI中获得HPV 58 L1基因序列,应用Clustal X2软件进行序列比对后,确定相对保守的目的基因序列;人工合成HPV 58 L1基因片段,PCR法获得截短型HPV58 L1-1基因,克隆至p Fast Bac-1载体中,构建重组供体质粒p FB-HPV 58 L1-1,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组Bacmid-HPV 58 L1-1,转染Sf9细胞,获得第1代(P1)重组杆状病毒BV-HPV 58 L1-1,扩增后采用快速滴定法测定病毒滴度;将重组杆状病毒感染Sf9细胞,表达HPV 58 L1-1蛋白,并进行Western blot分析和透射电镜观察。结果Bacmid-HPV 58 L1-1经PCR及测序鉴定构建正确;P2重组杆状病毒的滴度可达1.0×108 pfu/ml;HPV 58 L1-1在Sf9昆虫细胞中的表达产物经Western blot检测,可见相对分子质量约55 000的特异性反应条带,电镜观察可见L1蛋白自组装形成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)。结论成功在昆虫细胞中表达了HPV 58 L1-1蛋白,并自组装为VLPs,为预防型HPV疫苗的研究奠定了基础。     

小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1功能基因的克隆及原核表达

目的克隆小鼠鸟氨酸脱羧酶抗酶1(OAZ1)功能基因,原核表达并纯化OAZ1重组蛋白。方法采用RT-PCR法从小鼠黑色素瘤细胞总RNA中扩增OAZ1基因,通过重叠延伸PCR技术构建无需移码即可全长翻译的功能基因,并构建重组表达质粒pET15b/OAZ1-T,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。表达的重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果重叠PCR法扩增出692bp的OAZ1功能基因,重组表达质粒经酶切及测序鉴定正确,重组蛋白可在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达。纯化的重组蛋白纯度可达79.96%,且可与抗His标签抗体特异性结合。结论已成功克隆了小鼠OAZ1功能基因,原核表达并纯化了重组OAZ1蛋白。     

幽门螺杆菌hp1188基因的克隆及高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究幽门螺杆菌的黏附机制奠定基础。方法用PCR法从H.pylori标准株NCTC11637基因组DNA中扩增hp1188基因,克隆入原核表达载体pQE-30,构建重组原核表达质粒pQE30-hp1188,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达形式和表达量。表达蛋白经Ni2+-NTA树脂纯化,Western blot鉴定其反应原性。结果所构建的重组表达质粒pQE30-hp1188序列完整,插入的基因片段全长810bp,与GenBank中的hp1188基因同源性达98%。表达的重组蛋白相对分子质量约为30600,以1.0mmol/L IPTG诱导4h,表达量最高,破菌上清和沉淀中均有表达,可溶性蛋白表达量占全菌总蛋白的47%。重组蛋白纯化后纯度可达90%,并可被H.pylori患者血清识别。结论已成功克隆了H.pylori hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

幽门螺杆菌粘附素hpa A和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达

目的　构建幽门螺杆菌粘附素 (hpaA)和霍乱毒素B亚单位 (ctxB)融合基因的原核表达载体 ,诱导表达并进行纯化。方法　用PCR扩增hpaA和ctxB两个目的基因片段 ,克隆至同一pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pQE hct,转化E .coliDH5α ,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT ;经Westernblot分析其免疫原性 ,采用镍离子柱进行纯化。结果　经测序HCT融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子质量约为 4 0 0 0 0。可溶性蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组融合蛋白。经Westernblot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别。结论　已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达 ,为研制Hp口服疫苗提供依据     

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白的基因克隆与表达

目的　克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白基因napA ,为研究幽门螺杆菌致病机理提供材料。方法　用PCR从幽门螺杆菌DNA中扩增出目的基因napA ,定向插入原核表达载体pQE30中 ,测序分析确认后 ,转化大肠杆菌DH5α ,IPTG诱导表达 ,表达蛋白以NI2 + NTA柱进行纯化。结果　PCR扩增出 4 35bp目的基因片段napA ,克隆入pQE30质粒。工程菌诱导后SDS -PAGE显示新生表达蛋白带 ,相对分子质量为 170 0 0 ,与预期一致 ,约占菌体总蛋白的 38% ,经Ni2 + NTA柱纯化后可获得纯度为 95 5 %重组蛋白。Westernblot显示重组蛋白具有良好的抗原性。结论　克隆napA基因成功 ,并在大肠杆菌DH5α中高效表达。     

甘油脱水酶α亚基基因的克隆、表达及纯化

目的克隆甘油脱水酶α亚基基因,构建表达载体,表达并纯化融合蛋白。方法采用PCR技术克隆甘油脱水酶α亚基gldA基因,并将其重组到含组氨酸标签的表达质粒pET-32a(+)中。将重组质粒经热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达。表达产物经金属螯合层析柱纯化,并进行Western blot分析及活性检测。结果重组表达质粒pET/gldA经酶切鉴定及序列分析,证明构建正确。转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得可溶性表达,融合蛋白相对分子质量约81000,与预期大小一致。经Western blot分析,纯化蛋白能与6-Histidine抗体产生特异性免疫反应。α亚基经检测,未显示活性。结论已成功获得甘油脱水酶α亚基蛋白,为进一步研究其生物学性能奠定了基础。     

应用pCYB1载体表达胰高血糖素

目的 研制基因工程胰高血糖素。方法 利用pCYB1表达载体,亚克隆胰高血糖素基因后转化于BL21（DE3）菌种,并对阳性克隆的质粒进行DNA测序。检测不同条件下,IPTG诱导胰高血糖素-intein-几丁质结合结构域（CBD）组成的融合蛋白表达量,确定工程菌表达最适条件。利用几丁质结合柱进行亲和层析,在DTT作用下由intein在柱上进行自我切割,纯化胰高血糖素。SDS-PAGE检测融合蛋白表达量,SDS-PAGE在Tris-Tricine缓冲系统中电泳检测纯度,Lowry法检测蛋白质含量,Western blot检测免疫原性,升血糖实验检测活性并进行 N-末端测序。结果DNA测序显示表达产物基因序列正确,纯化胰高血糖素具有免疫原性和生物学活性,N-端15个氨基酸与天然产品相同,电泳呈单一谱带,产率为1.25mg/L。结论 获得分泌胰高血糖素基因工程菌,适于快速大规模生产。     

幽门螺杆菌VacA-HpaA融合蛋白的表达及其免疫学特性

目的构建H.pylori细胞空泡毒素VacA与黏附素HpaA融合基因的原核表达载体,诱导其表达融合蛋白,并检测表达产物的抗原性与免疫原性。方法用PCR从pQE30-VacA质粒扩增出VacA基因,克隆至pTrc99A-HpaA载体中,与HpaA基因融合后,插入原核表达载体pQE30中,再将pQE30-VacA-HpaA转化入大肠杆菌DH5α,诱导表达并提纯融合蛋白,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达,Bradford法检测融合蛋白含量,Western blot鉴定特异性。将融合蛋白免疫家兔,得到多克隆抗血清,用双向免疫扩散和ELISA检测免疫原性。结果SDS-PAGE显示融合蛋白相对分子质量约为65000,表达量在35%以上,主要以包涵体形式表达,蛋白含量为0·72mg/ml,具有良好的VacA和HpaA抗原性与免疫原性。结论VacA-HpaA融合蛋白已成功表达,且具有良好的免疫原性,为进一步研究制备H.pylori疫苗创造了条件。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因克隆及表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)过氧化氢酶(katA)基因并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌katA全长基因,将其克隆入pET-11c载体中,经测序证实后,在大肠杆菌中进行表达,产物用Western blot检测其抗原性并进行N末端氨基酸的测序。结果 幽门螺杆菌katA基因全长1 518bp,编码氨基酸505个。在BL21(DE3)中的表达量约占细菌总蛋白的24.9％,表达产物经SDS-PAGE显示其相对分子质量与软件预测结果 58 000相符,N末端5个氨基酸测序结果与Hp中天然的katA完全一致,经Western blot检测可被 Hp全菌抗血清识别。结论 katA能在大肠杆菌中进行高效表达,具有良好的免疫反应性,可望为研究 Hp的致病机理、实验诊断及亚单位疫苗等提供充足的katA原材料。     

人CD271基因的克隆及原核表达

目的克隆人CD271基因,并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术从人REH细胞系中扩增CD271基因,将其克隆入pET22b表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行纯化及Western blot鉴定。结果重组表达质粒pET22b/CD271经双酶切鉴定,可见1197bp的目的基因条带。表达产物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约75000处可见表达条带。IPTG浓度为0.5mmol/L时,目的蛋白表达量最高。纯化后蛋白纯度为82.5%。Western blot检测表明纯化后的蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆了人CD271基因,并在大肠杆菌中获得表达。     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB融合蛋白的表达及生物活性研究

目的 通过基因工程方法构建并表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)以基因形式的融合蛋白,并对其生物活性进行初步研究,为幽门螺杆菌疫苗的研究奠定基础。方法 用PCR方法从本室构建的融合基因克隆载体扩增出融合基因2 040bp的片段,将融合基因插入原核表达载体pET-11-c中。结果 经全自动测序仪测序,SDS-PAGE和免疫印迹以及N端氨基酸测序分析,证实融合蛋白已在BL21中表达,初步纯化后通过动物实验和酶联免疫吸附试验证实其相应的免疫原性和免疫反应性,以及其中LTB成分和GM1结合的特性。结论 融合蛋白表达方式为幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的研究奠定了基础。