Schnelle und hochaufl?sende Visualisierung von Enzymen in Polyacrylamidgelen

Zusammenfassung Eine einfache Methode zur Visualisierung enzymatisch aktiver Komponenten wird am Beispiel pectinolytisch, amylolytisch und proteolytisch wirksamer Enzyme beschrieben. Die Enzyme werden durch ultradünnschicht-isoelektrische Focussierung bzw. ultradünnschicht Gradientengelelektrophorese getrennt. Auf das Trenngel wird ein 120 m oder 240 m dickes, auf Folie polymerisiertes Acrylamidgel aufgerollt, welches ein für das jeweilige Enzym spezifisches und auf optimalen pH-Wert gepuffertes Substrat enthält. Nach einer definierten Reaktionszeit wird es vom Trenngel abgenommen, kurz in Wasser gewaschen, angefärbt und entfärbt. Die Trennschärfe der Focussierung oder Elektrophorese ist in den Abklatschgelen exakt reproduziert und die Nachweisempfindlichkeit gegenüber bisherigen Enzymvisualisierungen deutlich erhöht. Das Trenngel kann ohne wesentliche Bandenverluste zur Proteinanfärbung weiter behandelt werden.

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A rapid and sensitive method for visualization of enzymes in polyacrylamide gels

A simple method for activity staining of pectinolytic, amylolytic and proteolytic enzymes is described. The enzymes are separated by ultrathinlayer isoelectric focusing or ultrathinlayer gradient gel electrophoresis. After successful separation an ultrathin acrylamide gel on foil support containing a specific substrate buffered to optimal pH for the enzyme to be visualized, is pressed onto the surface of the separating gel. After the reaction time the print gel is removed, washed with water, stained and destained. The resolution of the ultrathinlayer isoelectric focusing or ultrathinlayer gradient gel electrophoresis is exactly reproduced in the print gel, the sensitivity in comparison to conventional activity staining methods is improved. The separating gel can be further employed for protein staining without loss of activity.

     

Analytik von Proteinen in Lebensmitteln mit elektrophoretischen und chromatographischen Verfahren

Zusammenfassung Die Leistungsfähigkeit der elektrophoretischen Methoden (Gelelektrophoresen, isoelektrische Focussierung, zweidimensionale Techniken) und chromatographischen Verfahren (Ausschluß-, Ionenaustausch-, Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie) zur Analytik von Proteinen in Lebensmitteln wird an Hand von umfangreicher Literatur sowie von ausgewählten Anwendungsbeispielen beschrieben.Die durch die Vielfalt der Proteinmuster gegebenen Unterscheidungsmöglichkeiten lassen sich bei Verwendung charakteristischer Proteinkomponenten (Indikatorproteine) infolge der Anpassungsfähigkeit und des hohen Auflösungsvermögens der elektrophoretischen und chromatographischen Methoden heute schon weitgehend ausnutzen. Auf diese Weise können auch eng verwandte, sehr ähnliche Lebensmittel tierischer oder pflanzlicher Herkunft anhand ihrer Proteinmuster eindeutig differenziert und in Mischungen meist auch quantitativ bestimmt werden. Durch gute Reproduzierbarkeit, Zuverlässigkeit und schnelle Ausführung eignen sich die genannten Methoden für einen Einsatz im Routinebetrieb. In der Literatur liegen Untersuchungen vor über Fisch, Fleisch und abgeleitete Produkte, Fremdeiweiß in Fleischprodukten, Milch, Käse, Cerealien und daraus hergestellte Lebensmittel, Leguminosen- und Ölsaatsamen, Früchte und Gemüse.

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Analysis of proteins in foods by means of electrophoretic and chromatographic methods

Summary The efficiency of electrophoretic methods (gel electrophoresis, isoelectric focusing, twodimensional techniques) and of chromatographic methods (size exclusion and ion exchange chromatography, reversed phase HPLC) to analyze proteins in foods is reviewed. Several selected applications are discussed in detail.The large diversity of proteins in a particular food results in a unique electrophoretic or chromatographic pattern, that can be used for identification purposes, by means of the so called indicator proteins. The adaptability and resolving power of the methods assure their extended application to many protein containing foods. The uniqueness of the patterns obtained warranties differentiations of even closely related animal or plant foods as well as mixtures of them. The methods also allow quantitative determinations of mixtures of foods. Their ease of handling and good reproducibility and reliability favours their use in routine analyses. Numerous investigations on fish, meat and derived products, non-meat proteins in meat products, milk, cheese, cereals and products made of cereals, oilseed proteins, legumes, fruits and vegetables described in the literature are here presented.

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Abkürzungen AGIF Isoelektrische Focussierung in Agarosegel - Disc-PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese in diskontinuierliehen Puffersystemen - IEF Isoelektrische Focussierung - IP Isoelektrischer Punkt - PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese - PAGIF Isoelektrische Focussierung in Polyacrylamidgel - SDS Natriumdodecylsulfat - SGE Stärkegelelektrophorese - MG Molekulargewicht (kD) - kD Kilo-Dalton - ME 2-Mercaptoethanol - SDS-PG-PAGE Natriumdodecylsulfat-Porengradient-Polyacrylamidgel-Elektrophorese - UDIEF Ultra-Dünnschicht-Isoelektrische Focussierung in Polyacrylamidgel - PE Papierelektrophorese Nach einem Vortrag auf der Tagung Biochemische Analytik 84: Symposium: Proteine in der Lebensmittelanalytik. München 10.–13.4. 1984     

Proteine des Bienenhonigs VI. Isoelektrische Focussierung der Amylase verschiedener Honigsorten

Zusammenfassung Von Begleitenzymen getrennte Amylase aus dem Proteinkonzentrat von Raps-, Tannen-und Zuckerfütterunghonig wurde mittels präparativer und analytischer isoelektrischer Focussierung (IeF) näher charakterisiert. Bei der präparativen IeF mußte festgestellt werden, daß die zum Aufbau des pH-Gradienten benutzten Ampholine (LKB) Jod verbrauchen und somit bei der üblichen Jod/Stärke-Reaktion Amylaseaktivität vortäuschen und daß Dextrangele als Träger aufgrund ihrer Wechselwirkungen mit dem Enzym die Focussierung erlagern.Hingegen führte die auf ultradünnen Polyacrylamidgelen vorgenommene analytische IeF mit den aus Proteinkonzentrat von Raps, Tannen- und Zuckerfütterungshonig isolierten Amylasen zu 10 jeweils übereinstimmenden Proteinbanden. Mit einer neu entwickelten Zymogrammtechnik konnte bei allen Banden Amylaseaktivität festgestellt werden, inaktive Banden lagen nicht vor. Der Glykoproteinnachweis war bei allen 10 Banden positiv.

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The proteins of honey VI. Isoelectric focusing of different honey amylases

Summary The isolated honey amylase was characterized by preparative and analytical isoelectric focusing. An interesting aspect of the preparative isoelectric focusing was the reduction of iodine by Ampholines which were used for building up a pH-gradient, giving a false increase in apparent amylase activity as determined by the iodine/starch reaction. Dextran gels were not suited for the matrix, because interactions with the enzyme disturb the focusing. From the analytical isoelectric focusing of isolated honey amylase in ultrathin layer Polyacrylamide gels 10 protein bands resulted. A newly developed zymogram technique was positive for amylase activity in all 10 protein bands.

     

Liquid-Chromatographie von Weinen und Fruchts?ften

Zusammenfassung Mit Hilfe der Liquid-Chromatographie (LC) können in Weinen und Fruchtsäften quantitative Bestimmungen der Sorbinsäure, Milchsäure, Äpfelsäure, Weinsäure und Citronensäure durchgeführt werden. Als Probenvorbehandlung ist lediglich das Entfernen der Kationen durch Schütteln mit einem festen Kunstharzaustauscher erforderlich. Die relativen Standardabweichungen der Methode liegen zwischen 2 und 6%. Im Vergleich zu den amtlich vorgeschriebenen Bestimmungsmethoden der Säuren wurden keine systematischen Abweichungen festgestellt. Ferner haben wir Möglichkeiten aufgezeigt, über die Säurendiagramme die Identität zweier Weine nachzuweisen sowie das Ausgangsmaterial einzelner Essigsorten zu bestimmen.

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Liquid chromatography of wines and fruit juices.2. Preparation of samples, quantitative determination of acids and further practical applications

Summary By means of liquid chromatography sorbic, lactic, malic, tartaric, and citric acid can be determined quantitatively in wines and fruit juices. Sample preparation only necessitates removal of the cations by shaking with a solid synthetic ion exchange resin. Relative standard deviations of the method are between 2 and 6%. As compared to the official methods of determination for these acids no systematic deviations have been found. Furthermore we demonstrate possibilities how to prove the identity of two wines as well as the starting material of different kinds of vinegar by acid diagrams.

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Die Arbeit wurde im Rahmen des SFB Analytik Saarbrücken durchgeführt. Für die Bereitstellung der Geräte und Sachmittel danken wir der DFG bestens.     

Proteindifferenzierung mit elektrophoretischen Methoden bei Fleisch, Fisch und abgeleiteten Produkten

Zusammenfassung Bei binären, rohen Fleischmischungen ist eine Erkennung der vorliegenden Tierarten durch isoelektrische Focussierung wäßriger Extrakte möglich. Die densitometrische Auswertung der Proteinpherogramme erlaubt eine quantitative Analyse solcher Mischungen bis herab zu einem Anteil von 2–5% an einer Komponente. Die Methode hat einige Vorteile gegenüber immunochemischen Methoden.

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Protein Differentiation with Electrophoretic Methods in Meat, Fish and Derived ProductsII. Qualitative and Quantitative Analysis of Raw Binary Meat Mixtures by Means of Isoelectric Focusing in Polyacrylamide Gel

Summary The identification of animal species in raw binary meat mixtures is possible by means of isoelectric focusing of the aqueous extracts. Densitometric evaluation of the protein pherograms makes possible the quantitative analysis of such mixtures down to a minimum level of 2–5% of one of the components. The method has some advantages as compared to immunochemical methods.

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I. Mitteilung: Kaiser et al [1]     

Rapid determination of malic and citric acid in apple juice by high performance liquid chromatography

Summary Malic and citric acid can easily be determined in apple juice by means of reversed-phase high-performance liquid chromatography. Sample preparation is not necessary. For some juices a comparison is made with the enzymatic and Rebelein methods. Adulterations can rapidly be recognised by this method.

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Schnelle Bestimmung von Apfelsäure und Citronensäure in Apfelsäften mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

Zusammenfassung Mit Hilfe der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit umgekehrter Phase können quantitative Bestimmungen der Apfelsäure und Citronensäure in Apfelsäften durchgeführt werden. Eine Vorbehandlung der Proben ist nicht notwendig. Zum Vergleich sind enzymatische und Rebelein-Methoden durchgeführt worden. Mit Hilfe unserer Methode können Verfälschungen schnell erkannt werden.

     

Evaluation of Soxhlet's and Bligh and Dyer's methods in the determination of fat in meat

Summary A comparative evaluation of Soxhlet's and Bligh and Dyer's methods in determination of fat in meat was carried out. With the statistical analysis the following was estimated: the influence of each method on the level of fat determination with regard to the kind of the meat examined, and the precision and error of the results obtained with each method.

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Zusammenfassung Es wurde eine vergleichende Bewertung der Soxhlet- und Bligh and Dyer-Methoden zur Bestimmung des Fettgehaltes im Fleisch durchgeführt. Statistisch wurde der Einfluß beider Methoden auf die Höhe der Ergebnisse in Abhängigkeit von der die Art des untersuchten Fleisches sowie die Genauigkeit und die relativen Fehler der mit jeder einzelnen Methode erhaltenen Ergebnisse überprüft.

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Supported by PL-480 Grant No. FG-229 from the U.S. Department of Agriculture.