一株拮抗酿酒葡萄灰霉病的枯草芽孢杆菌T3筛选、鉴定及抑菌分析

为筛选出对酿酒葡萄灰霉病具有良好抑制作用的拮抗菌,从酿酒葡萄根际土壤进行微生物分离,以灰葡萄孢(Botrytis cinerea)为靶标菌株,采用牛津杯法对拮抗菌进行筛选,通过形态学、生理生化特征以及16S rDNA进行鉴定分析,对拮抗菌进行生长特性及抑菌分析。结果表明:筛选出一株对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)具有显著抑制作用的T3菌株,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),培养24~48 h T3菌株进入稳定期,最适的生长温度为37 ℃,最适pH为7.0。T3菌株对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)MIC为3.6×105 CFU/mL,MBC为3.6×106 CFU/mL,3.6×109 CFU/mL T3菌株对灰葡萄孢(Botrytis cinerea)抑菌直径为31.6±0.2 mm(P<0.05),抑菌效价为158.0±1.0 mm/mL(P<0.05)。扫描电镜观察T3菌株造成灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌丝畸形、扭曲、顶端膨大、原生质收缩、孢子稀松,抑制菌丝生长及孢子萌发。本实验为酿酒葡萄灰霉病的生物防治提供新的微生物资源,具有进一步研究价值。     

1株树莓果实采后病原真菌的rDNA ITS序列及碳源代谢指纹图谱分析

为增强对树莓果实采后病害防治的针对性,从采后贮藏期间自然发病的"泼鲁德"树莓果实中分离到1株真菌菌株079#。通过形态学观察以及rDNA ITS序列分析确定为桃吉尔霉(Gilbertellapersicaria)。通过Biolog FF Micro Plate分析桃吉尔霉对95种碳源的代谢指纹图谱,发现培养168 h时其最适碳源有蔗糖、D-核糖、阿拉伯糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸、γ-氨基丁酸、D-苹果酸,癸二酸、琥珀酰胺酸、D-山梨醇、木糖醇、N-乙酰-D-半乳糖胺、L-天冬氨酸、L-丙氨酸、L-谷氨酸等64种,而不可利用碳源主要有N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、核糖醇、D-阿拉伯糖醇、D-纤维二糖、环式糊精、D-果糖、L-海藻糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、龙胆二糖、葡糖醛酰胺、m-肌醇、麦芽糖、β-甲基-D-半乳糖苷、D-阿洛酮糖等19种。     

5株桃、李果实采后褐腐病菌鉴定、rDNA ITS序列与碳源代谢指纹图谱分析

从采后贮藏过程中发病的桃、李果实中分离到5株丝状病原真菌。对其进行形态学特征观察以及核糖体rDNA ITS序列分析和95种碳源代谢指纹图谱分析。结果表明:5株病原真菌均为果生链核盘菌(Monilinia fructicola),其中091#和089#菌与Monilinia fructicola(FJ515894)的亲缘关系较近。5株褐腐病菌对D-果糖、麦芽糖、蔗糖等共56种碳源的代谢能力相同,包括51种最适碳源和5种不可利用碳源,其中Monilinia fructicola 091#与089#的代谢指纹图谱最接近,而Monilinia fructicola 086#、071#、072#的代谢指纹图谱最接近。因此利用rDNA ITS序列和碳源代谢指纹图谱均可区分桃、李果实5株褐腐病菌不同菌株之间的差异,且两种方法具有可比性。     

3株罗伦隐球酵母的26S rDNAD1/D2区序列、代谢指纹图谱及生防效力比较分析

研究3株不同来源的酵母拮抗菌(Crytococcus laurentii)001#、010#和012#的种间亲缘关系、Biolog微生物鉴定系统中的不同碳源物质代谢指纹图谱以及对于不同果蔬的侵染病原菌的生防效力。结果表明:亲缘关系相近的菌株001#和010#间的碳源代谢指纹图谱中存在43种相同的最适碳源和13种相同的可利用碳源,菌株012#则与001#和010#利用碳源情况差异性较大,但是它们分别在梨、油桃和芦笋果实上的生防效力却有一些差别,这可能与不同菌株所特异利用的碳源种类以及果蔬中含有的特异的碳源种类和含量有关。发现不同果实的碳源成分和比例引起的拮抗菌生防效果差异的现象,并揭示亲缘关系能在一定程度上通过菌株的碳源代谢特征表现出来,为酵母拮抗菌在生防效力作用机理研究提供参考。     

5株杏果实采后病原真菌的分离及鉴定

杏采后易受病原菌侵染,本研究通过对采后贮藏期间‘金太阳杏’和‘胭脂杏’果实发病部位的病原菌进行分离、纯化,并将纯化后的菌株回接到相应品种的健康果实上,出现与分离发病果实相同的病症,经形态学特征分析、真菌r DNA内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）的序列分析并构建系统发育树,从杏果实共分离到5株病原菌。从‘金太阳杏’分离到3株病原真菌,其中325#为甜樱间座壳菌（Diaporthe eres）,327#为葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）,328#为出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）,从‘胭脂杏’果实分离得到两株病原真菌,分别为326#椭圆葡萄孢菌（Botrytis elliptica）和331#灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。D. eres、B. dothidea、A. pullulans和B. elliptica为杏果实上未见文献报道的病原真菌,而B. cinerea未有发现侵染‘胭脂杏’的报道,研究结果旨在为杏果实的生物防治措施提供一定的参考。     

1株桃果实采后病原真菌的鉴定以及碳源代谢指纹图谱分析

从采后贮藏过程中发病的八月脆桃果实(Amygdalus persica cv.Bayuecui)中分离到1株真菌菌株074#.通过对病原菌形态学观察以及核糖体ITS rDNA序列分析,证明菌株074#为灰葡萄孢霉菌(Botrytis elliptica).致病性试验结果表明,桃果实为灰葡萄孢霉菌的寄主.通过Biolog...     

蓝莓采后主要病原菌的分离鉴定及肉桂精油抑菌效果

为明确山东泰安地区蓝莓采后主要致腐病原菌及肉桂精油对其抑菌效果,从自然腐烂的“晚丰”蓝莓上分离纯化优势菌株,采用传统真菌形态学鉴定方法结合rDNA-ITS序列分析方法进行鉴定,并采用体外熏蒸抑菌实验研究肉桂精油对几种主要致病菌的抑制效果。结果表明,泰安本地蓝莓分离到3 株病原真菌,分别为尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、链格孢菌（Alternaria alternata）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）。体外抑菌实验表明,肉桂精油对尖孢镰刀菌、链格孢菌和灰葡萄孢菌均有较好的抑制效果,其最小抑菌浓度分别为60、30 μL/L和30 μL/L;通过扫描电镜可以看出,与对照组相比,经肉桂精油处理的3 种病原菌菌丝形态均受到严重破坏,发生凹陷、皱缩、粗糙等一系列变形现象。     

宁夏贺兰山东麓葡萄灰霉病菌类群分析

为明确宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄灰霉病菌的类群，从6个葡萄酒庄采集30份葡萄灰霉病果实样本，并对葡萄灰霉病原菌进行分离和纯化，通过形态学分析、致病性测定和分子生物学方法对其进行类群划分。结果表明，分离纯化所得到的13株葡萄灰霉病菌株，依据培养性状、产孢量、微菌核和致病性将其划分为8大类群，依据G3PDH、Bc729、Bchch和Rpb2基因对8株代表性菌株进行分子鉴定，表明均为灰葡萄孢（Botrytis cinerea），但基因碱基序列略有差异，与形态学类群划分结果基本一致。本研究综合调查了贺兰山东麓酿酒葡萄灰霉病菌的类群，为贺兰山东麓酿酒葡萄产区葡萄灰霉病的有效防治提供理论依据。     

人工贵腐玫瑰蜜葡萄酒的酿造及香气成分分析

以玫瑰蜜葡萄为原料,通过人工接种贵腐菌的方法来获得贵腐葡萄,评价人工酿造贵腐玫瑰蜜葡萄酒技术的可行性。本研究在感染灰霉病的夏黑葡萄果实上分离灰葡萄孢(Botrytis cinerea)菌株,通过形态学和分子鉴定,确定分离菌株为灰葡萄孢(B. cinerea)。然后用喷洒孢子悬浮液的方法对玫瑰蜜葡萄进行人工接种,获得贵腐葡萄,酿造贵腐葡萄酒。用顶空固相微萃取气质联用(HS-SPME-GC-MS)分析人工贵腐酒的香气成分,通过与对照相比,人工贵腐酒一共检测到了42种香气物质,对照检测到了29种。通过分析发现玫瑰蜜人工贵腐酒含有更多种类的酯类和醛酮类化合物,具有典型的香气成分,更加丰富和复杂的香气特征。     

李果实贮藏期间4 株病原真菌的分离、鉴定及 碳源代谢指纹图谱分析

从采后贮藏过程中发病的“安哥诺”(Prunus angeleno)和“黑琥珀”(Prunus salicina cv. Black amber) 李果实中分离到4株丝状病原真菌。通过对病原菌株形态学特征观察以及核糖体rDNA ITS序列系统分析,确定菌株059#为串珠状赤霉(Gibberella moniliformis)、菌株067#为链格孢菌(Alternaria alternata)、菌株087#为草酸青霉(Penicillium oxalicum)以及菌株088#为塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)。进一步利用Biolog FF MicroPlate分析病原菌对95种碳源的利用能力,结果表明这4种病原菌的最适碳源皆在77种以上,且共同的最适碳源包括D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、苹果酸和柠檬酸等45种。     

蓝莓贮藏期病原菌的分离鉴定及植物粗提物抑菌效果研究

以湖南省长沙县的兔眼蓝莓(粉蓝)为试材,分离并鉴定出自然贮藏过程中引发蓝莓果实腐烂变质的3株主要病原真菌(LM-1、LM-2和LM-3),同时采用牛津杯法开展21种植物乙醇粗提物对其中2株低温贮藏中重要致病真菌的抑菌活性筛选,并确定其最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。经形态学观察和18S r DNA序列分析将3株病原真菌分别鉴定为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、互隔交链孢霉(Alternaria alternata)和类阿达青霉(Penicillium adametzioides)。抑菌实验结果表明,丁香对灰葡萄孢菌和互隔交链孢霉的抑制能力最强,0.5 g/m L丁香提取液对灰葡萄孢菌和互隔交链孢霉的平均抑菌圈直径分别达47.55、40.66 mm,MIC分别为15.63、31.25 mg/m L,MBC分别为31.25、62.5 mg/m L。     

葡萄灰霉病病原菌鉴定及天然药物的抑制效果评价

采用形态学特征观察及SCAR标记检测等方法,对四川成都葡萄产区葡萄灰霉病病原菌进行分离鉴定和致病力检测,并利用天然中草药提取物对葡萄灰霉病病原菌进行体外抑菌试验。结果表明,四川成都产区葡萄灰霉病的病原菌均为灰葡萄孢(Botrytis cinerea),其对不同葡萄品种致病力差异较大,对‘黑巴拉多’致病力最强,第6天平均病斑直径达9.500 mm;对主栽品种‘巨峰’的致病力较弱,为5.756 mm;而对‘巨玫瑰’无明显致病性。中草药丁香、厚朴提取液对灰葡萄孢抑菌效果最好,在醇提物质量浓度为200 mg/mL时,平均抑菌圈直径均达到40 mm以上,抑菌率大于87%,EC_(50)分别为0.218、0.420 mg/mL,可用于制备灰霉病天然防治药物。     

采前水杨酸处理对红地球葡萄潜伏侵染及采后灰霉病的防控效果

为明确采前水杨酸处理对葡萄潜伏侵染及采后灰霉病的影响,本研究首先分离并鉴定红地球葡萄生长过程中的主要潜伏侵染真菌,并研究水杨酸（salicylic acid,SA）对灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）的抑菌效果及对果实抗性基因的诱导作用。本文以新疆红地球葡萄为试材,选取0（对照）、0.5、1.0、2.0 mmol/L水杨酸（SA）在膨大期、转色期和采收前2 d （预收期）喷施处理葡萄果穗,采用组织分离法分离不同时期潜伏侵染果实的病原真菌,通过形态学和分子生物学方法,对病原菌进行分类鉴定,明确主要潜伏侵染真菌的种类,统计果实采后损伤接种Botrytis cinerea后病斑直径和发病率的变化,并分析果实相关抗性基因的表达情况。结果表明:采前SA处理可以显著降低果实生长期间潜伏真菌率,对葡萄果实不同部位的潜伏侵染控制效果显著,1.0 mmol/L SA处理组优于其它组,其中对果实底部和果蒂潜伏侵染的控制效果优于顶部和果梗。此外,生长期果实共鉴定出4种主要潜伏病原真菌,分别为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）、互隔交链孢霉（Alternaria alternate）、变色青霉（Penicillium discolor）和黑曲霉（Aspergillus niger）。1.0 mmol/L SA处理能显著抑制B.cinerea侵染造成灰霉病发病率上升和病斑直径的扩大,SA处理可在贮藏前期诱导采后葡萄果实VvPAL1、VvChi4D和VvGlu1基因的表达,中期后期诱导VvPAL2、VvPAL7和VvPAL15的基因表达,起到提高果实抗病性。因此,SA采前处理能提高红地球葡萄对潜伏侵染病害的抗性,对采后灰霉病也有较显著的抑制效果。     

3株哈密瓜致腐病原菌的分离鉴定及碳源代谢分析

哈密瓜在贮藏和运输过程中极易出现腐败,本研究采用组织分离法从贮藏过程中自然腐烂的哈密瓜分离纯化出致腐病原菌3株,通过形态学观察、ITS测序分析、表型分析的方法鉴定出菌株CYS为赭曲霉（Aspergillus ochraceus,JN942915.1）,菌株CJS为粉红单端孢（Trichothecium roseum,KM877467.1）,菌株CWS为娃儿藤内生真菌（Diaporthe sp.,LT965977.1）;采用Biolog-FF技术对3株致腐病原菌的生长和代谢能力进行分析,发现菌株CYS代谢的主要碳源有44种,对羧酸的代谢能力最强,其次为氨基酸和糖;菌株CJS代谢的主要碳源有22种,对氨基酸的代谢能力最强,其次为羧酸和糖;菌株CWS代谢的主要碳源有41种,对糖的代谢能力最强,其次为羧酸和氨基酸。由此可以分析,果蔬表面及环境中存在的病原菌会因为有利于其生长的物质（如糖类、氨基酸、羧酸类物质）存在而加快代谢速度,从而会加速果蔬腐烂变质。通过本研究结论可以进一步揭示致腐病原菌侵染机制,并为果蔬贮藏技术研究提供理论依据。     

甜樱桃采后腐烂病原菌的分离与鉴定

为了研究山西省甜樱桃果实采后贮藏过程中的病原菌,本文对低温贮藏过程中发生腐烂的甜樱桃果实的病原菌进行分离纯化。在形态学基础上,结合基因序列分析,对分离获得的2株病原真菌YTA、YTB进行鉴定。YTA和YTB利用真菌通用引物ITS序列进行PCR扩增,将测序所得的基因序列与NCBI的GenBank进行同源序列比对,确定甜樱桃病原菌的生物学分类。结果表明:病原菌YTA为草酸青霉(Penicillium oxalicum),YTB为葡萄孢属(Botrytis sp.),将其重新回接到甜樱桃上,均能引起甜樱桃腐烂。草酸青霉(Penicillium oxalicum),葡萄孢属(Botrytis sp.)均是造成山西省甜樱桃采后腐烂的病原菌。     

贵腐菌的筛选鉴定及培养条件优化

为明确山东乳山迟采酿酒葡萄‘贵人香’引发贵腐作用的菌种及培养条件,以形态学为基础,结合生理生化及分子生物学方法对被侵染的‘贵人香’葡萄进行菌种分离鉴定。结果表明,从被侵染的葡萄中筛选出68株菌种,通过形态学观察、生理生化鉴定以及ITS rDNA序列分析,确定有3株贵腐菌(Botrytis cinerea),分别命名为GRX06、GRX08、GRX62。各菌株均在改良PDA培养基上生长良好,但GRX06以葡萄糖为碳源、牛肉膏为氮源的培养基上表现较好,GRX08以甘露醇为碳源、硝酸钾为氮源的培养基上生长较好,GRX62以甘露醇为碳源、酵母粉为氮源的培养基上表现较佳。GRX06和GRX08以改良PDA培养基在pH 6和25 ℃条件下生长良好,GRX62以改良PDA培养基在pH 8和20 ℃下生长良好,光照时间对这些菌株的生长无显著影响。     

葡萄灰葡萄孢生长及产孢条件研究

灰葡萄孢(Botrytis cinerea)可引起葡萄灰霉病,严重影响葡萄产量和品质。探索不同培养基、温度、光照、碳源、氮源等对葡萄灰葡萄孢菌丝生长和分生孢子产生的影响,以及菌丝与分生孢子的致死温度和时间,旨在探索灰葡萄孢生长及产孢的最佳条件。结果显示,灰葡萄孢菌丝生长的最适培养基为PDA培养基,最适温度25℃;产孢最适培养基为MSM培养基,最适温度23℃;在培养基pH3~11范围内灰葡萄孢均能生长并产生分生孢子,菌丝生长和产生分生孢子的最适pH均为6;灰葡萄孢以葡萄糖和乳糖为碳源时生长速率和产孢量达到最佳,而蛋白胨则为灰葡萄孢生长和产孢的最佳氮源;菌丝的致死条件是50℃处理25 min或55℃处理10 min;分生孢子的致死条件是45℃处理30 min或50℃处理10 min。研究为葡萄灰霉病的有效防治及分子生物学研究提供理论依据。     

茉莉酸甲酯对脆红李采后病原菌的抑制作用

为确定脆红李果实采后主要病原菌的种类及茉莉酸甲酯对其抑制效果,从脆红李贮藏期病果中分离纯化病原菌,通过致病性检测、形态学鉴定和rDNA-ITS序列分析对病原菌进行鉴定;并采用体外实验研究不同浓度的茉莉酸甲酯（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mmol/L）对脆红李采后主要致病菌的抑制效果及室内毒力测定。结果表明,引起脆红李采后腐烂的病原菌主要为灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和链格孢菌（Alternaria alternata）;经体外实验得出,不同浓度的茉莉酸甲酯能抑制两株病原菌菌丝的生长,其中,0.4 mmol/L及0.5 mmol/L的茉莉酸甲酯能够有效抑制脆红李采后病原菌的生长,但其对病原菌的抑制作用无显著差异（P>0.05）;在体外培养5 d时,0.4 mmol/L的茉莉酸甲酯对灰葡萄孢菌和链格孢菌的抑制率分别为89.3%、86.3%;在培养2 d时,茉莉酸甲酯对灰葡萄孢菌和链格孢菌的EC50分别为0.154、0.228 mmol/L,而在5 d时为0.193、0.348 mmol/L。由此得出适宜浓度的茉莉酸甲酯能够有效抑制脆红李贮藏期病原菌的生长,后期可将其用于脆红李采后病害的防治及贮藏保鲜的研究。     

山西部分地区树莓采后主要侵染性病原真菌的鉴定及其生物学特性

树莓(Rubus corchorifolius L. f.)采后易受病原菌侵染，病菌种类不但与果实种类有关，而且与栽培环境相关。本研究对山西省太原市、阳泉市和长治市3个不同产区的树莓采后主要侵染性病原真菌进行分离鉴定并研究其生物学特性，对病原菌进行分离纯化，结合形态学和分子生物学特征确定其种类，明确在同期内病原菌产孢量和在不同条件下病原菌生长情况。结果表明，所研究3个地区侵染采后树莓病原菌主要为拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)、皮落青霉(Penicillium crustosum)、葡萄孢霉(Botrytis sp.)和少根根霉(Rhizopus arrhizus)。皮落青霉(Penicillium crustosum)的产孢能力最强，其次是葡萄孢霉(Botrytis sp.)和少根根霉(Rhizopus arrhizus);4种致病菌最适生长pH为7，以皮落青霉(Penicillium crustosum)生长最快；0、4和10℃贮藏期间以葡萄孢霉(Botrytis sp.)和皮落青霉(Penicillium crustosum)生长较快，拟康宁木霉(T...     

4株无花果病原真菌分离鉴定与碳源代谢指纹谱分析

无花果果实皮薄多汁,采后易受微生物侵染。分离筛选采后贮藏期间无花果发病部位的病原真菌,结合形态学观察、真菌rDNA内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列分析、系统发育树构建进行研究,并将分离得到的病原真菌回接至健康果实,发现健康果实出现与发病果实相同的病症。最终从无花果叶子和果实上分别分离到4株丝状病原真菌,其中179^#为链格孢菌(Alternaria alternata)、180^#为气味镰刀菌(Fusarium odoratissimum)、181^#为内生炭疽杆菌(Colletotrichum endophyticum)和182^#为总枝状毛霉(Mucor racemosus),其中气味镰刀菌、内生炭疽杆菌和总枝状毛霉为无花果中未见报道的病原真菌。利用Biolog微生物鉴定系统对4株病原真菌进行碳源代谢指纹谱分析,发现它们对60种碳源具有相似的代谢特征,包括L-阿拉伯糖、D-纤维二糖和α-环式糊精等56种可利用碳源以及N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、L-海藻糖和D-乳酸甲酯4种不可利用碳源。研究结果旨在为无花果病原真菌的生物学特征以及采后病害防治的研究提供参考依据。