重组Bacillus subitilis(pMA5/lapgad)的构建及其在γ-氨基丁酸合成中的应用

从实验室保存的Lactobacillus plantarum ZJ3443中克隆得到GAD基因,并对其进行了生物信息学分析。利用得到的GAD基因构建质粒pMA5/lapgad,在Bacillus subtilis WB600系统中实现了GAD基因的异源重组表达,其胞内酶活达到0.35 U/mg。在此基础上对摇瓶下利用重组菌全细胞转化谷氨酸合成γ-氨基丁酸的条件进行了优化,其最佳条件为:转化温度37℃,转化pH为4.5,添加1 mmol/L Ca2+作为激活剂。这是国内首次报道GAD在枯草芽孢杆菌中的活性表达,为利用基因工程技术实现全细胞合成γ-氨基丁酸打下了基础,为生产实践提供了一定的指导意义。     

D-阿洛酮糖 3-差向异构酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达

将D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DPE)基因利用PCR进行扩增,与枯草芽孢杆菌载体p MA5连接,构建重组质粒p MA5-cbdpe。重组质粒转入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB800感受态细胞,利用卡那霉素筛选和PCR鉴定,获得一株DPE重组枯草芽孢杆菌菌株。该重组菌株无需诱导即可产生DPE酶,18 h时酶活可达6.8 U/m L。该酶最适p H为7.0,最适温度为55℃,与大肠杆菌表达的DPE酶酶学性质相似。结果表明,DPE酶可在枯草芽孢杆菌中表达。     

产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶。本研究构建了4株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌,首次实现了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis IL 1403)来源的谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的食品级表达。通过比较4株重组枯草芽孢杆菌的生长曲线和发酵酶活曲线,筛选出产酶效率最高的重组菌株B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal,该重组菌在初始发酵培养基中发酵42 h后发酵酶活可达4.1 U/mL。通过调整培养基成分,重组菌B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal的发酵酶活最高达到7.4 U/mL,与初始相比酶活提高了79%,是目前已报道重组枯草芽孢杆菌产谷氨酸脱羧酶酶活的最高水平。     

β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢杆菌表达、酶学性质分析及其在宝藿苷Ⅰ制备中的应用

为获得安全高效的β-葡萄糖苷酶用于生物催化淫羊藿苷水解制备宝藿苷I,通过大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pMA5在食品安全菌株枯草芽孢杆菌WB600中异源表达Thermotoga petrophila来源的耐热β-葡萄糖苷酶TpBgl3,研究了所表达重组酶的酶学性质及其水解宝藿苷制备宝藿苷I的工艺条件.结果表明,菌株在3...     

枯草芽孢杆菌全细胞转化高效合成D-阿洛酮糖

D-阿洛酮糖是一种重要的稀少糖,在食品、化妆品和医药等领域都有着广泛的应用价值。目前,工业上生产D-阿洛酮糖以生物酶法为主。由于传统酶法存在步骤烦琐、成本高、产物纯化分离难等缺点,已难以满足工业生产需要。近年来,全细胞合成体系以其低成本、便操作、易分离等特点受到人们的关注。以一种来源于Caballeronia insecticola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)为研究对象,实现了在生产安全菌株枯草芽孢杆菌WB800中的高效异源表达,并以D-果糖为底物全细胞催化合成D-阿洛酮糖。为了提高DAEase的表达量,通过设计构建含有不同组成型启动子的重组菌株对其表达进行了优化。并对全细胞反应体系的条件(温度、pH值、金属离子、细胞浓度)进行了优化,探究了不同底物浓度下D-果糖的转化效率。结果表明：启动子P_ylbP介导下的重组DAEase在枯草芽孢杆菌WB800内具有较高的表达水平,重组DAEase全细胞反应的较适温度为65℃,较适pH值为9.5,较适金属离子为5 mmol/L Mg²⁺。采用全细胞方法以500 g/L D-果糖为底物制备D...     

脯氨酸氨肽酶枯草芽孢杆菌分泌表达及特性表征

构建重组枯草芽孢杆菌大量分泌米曲霉脯氨酸氨肽酶,纯化后对其基本酶学性质进行表征。将脯氨酸氨肽酶cDNA序列从载体pMD19-pap上克隆后连接到载体pMA5上得到重组质粒,转化枯草芽孢杆菌WB600后进行分泌表达。通过在培养基中加入5%D-山梨醇和2 mmol/L CaCl2,胞外酶活由7.5 U/mL提高到36 U/mL。通过硫酸铵盐析、Hitrap Q和SuperdexTM75对重组脯氨酸氨肽酶进行了纯化,纯化后的比酶活为247.3 U/mg,纯化倍数达到8.8倍。该酶最适温度为50℃,最适pH为7.5,米氏常数Km和最大反应速率Vmax分别为0.171 mmol/L和55.99μmol/(L·min)。     

木聚糖酶xynZF-318在枯草芽孢杆菌WB600中的表达及发酵条件优化

为了获得产木聚糖酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌,本研究将木聚糖酶基因xynZF-318与高表达载体pWB980连接,获得重组载体pWB980/xynZF-318,并将其通过电击转化的方法导入枯草芽孢杆菌感受态细胞WB600,获得重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318。采用单因素及响应面法对该工程菌进行摇瓶发酵工艺优化。结果表明:重组工程菌WB600/pWB980/xynZF-318最优的发酵条件为:接种量为1.2%、装液量为20 mL、种龄为11 h、培养温度为37 ℃、摇床转速为160 r/min、发酵时间为168 h。验证后实际酶活力为0.359 U/mL,与野生株WB600相比酶活提高了2.66倍。本研究成功构建了产木聚糖酶的枯草芽孢杆菌工程菌,有望为木聚糖酶的工业应用尤其是食品工业应用提供新思路。     

耐热β-半乳糖苷酶重组菌WB600/pMA5-bgaB发酵条件的研究

耐热β-半乳糖苷酶相比酵母来源的中温乳糖酶用于低乳糖牛奶的生产具有潜在的优越性。在已将来源于嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热β-半乳糖苷酶基因(bgaB)克隆入枯草芽孢杆菌得到重组菌WB600/pMA5-bgaB后,对此重组菌的发酵条件进行了研究。重组菌WB600/pMA5-bgaB在发酵过程中具有良好的遗传稳定性,可溶性淀粉和胰蛋白胨是重组菌生长和酶活表达的适合碳源和氮源。WB600/pMA5-bgaB适宜的摇瓶培养条件为接种量3%～5%,装液量30～50/250 mL(三角瓶),起始pH7.0,摇床转速220r/min。在7L反应器中进行分批发酵,研究表明,pH调控和溶氧控制对提高工程菌发酵产酶具有明显帮助,pH控制在7.0,溶氧控制在50%可提高发酵酶活;补料培养后菌体密度OD_(600)可达到47,酶活达到37.5U/mL,比在初始条件下提高了10倍。     

D-阿洛酮糖3-差向异构酶在枯草芽孢杆菌中的表达

D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase, DPE)可以催化D-果糖转化为稀有糖D-阿洛酮糖,是生产D-阿洛酮糖过程中的关键酶。为了提高DPE的表达水平,该研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) WB800为宿主菌,异源表达Clostridium scindens ATCC 35704来源的DPE。首先,构建不同单启动子和串联启动子介导DPE表达的重组菌,通过摇瓶培养,发现由单启动子P_hag介导的重组菌株经发酵后酶活力最高,最高酶活力为19.62 U/mL,是P₄₃介导的原始菌株酶活力的1.3倍。最后对P_hag的核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)序列进行突变,突变后的菌株酶活力再次提高了29.4%,是原始菌株酶活力的1.69倍。该研究结果为工业化生产DPE提供了方法学参考。     

极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达

为探索极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis WB600）中的高效分泌表达条件,对来源于枯草芽孢杆菌的9?种Sec分泌途径信号肽进行筛选,结果显示信号肽YfkN的引导分泌效率最高。在此基础上,为进一步优化PFA的分泌表达,对信号肽YfkN的Ile3和Gln4进行饱和突变,并比较不同突变体的引导分泌效率。结果表明突变体I3G/Q4R的引导分泌效率最高,重组枯草芽孢杆菌的胞外α-淀粉酶活力高达715?U/mL。重组α-淀粉酶PFA的最适反应pH值为5.0,最适反应温度为100?℃,于100?℃的半衰期长达13?h,并且不依赖于Ca2＋。结果表明,采用信号肽I3G/Q4R,极端嗜热酸性α-淀粉酶PFA能够在枯草芽孢杆菌中高效分泌表达,这有利于其在淀粉液化工艺中的应用。     

一种耐低温α-乙酰乳酸脱羧酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达

从Bacillus subtilis L5-20染色体上克隆得到ALDC基因alsD,构建重组表达载体pMA5-alsD-His,将其转化到B.subtilis WB600中。SDS-PAGE结果显示ALDC在重组B.subtilisWB600中成功表达,其相对分子质量(Mr)为32×103。采用Ni柱亲和层析纯化重组ALDC,所得纯酶的比酶活为272.3 U/mg,总回收率为89.8%。该重组ALDC最适反应温度仅为25℃,在20～35℃范围内均表现出较高的活性。Ni2+对ALDC有一定的激活作用,Fe3+使ALDC活性完全丧失。经摇瓶培养,重组菌的ALDC酶活为27.0 U/mL,约为出发菌酶活的70倍。经5 L的发酵罐发酵放大试验,ALDC酶活最高可达75.9 U/mL。     

重组枯草芽孢杆菌分泌表达腺苷酸脱氨酶

目的：利用基因重组技术,构建腺苷酸脱氨酶高效表达的重组菌株。方法：以前期构建的产腺苷酸脱氨酶重组大肠杆菌BL21（DE3）/pET28α-AMPD中来源于鼠灰链霉菌（Streptomyces murinus）目的基因为模板,设计特异性引物扩增腺苷酸脱氨酶基因,亚克隆至游离型表达载体pHY-WZX,转化枯草芽孢杆菌WB600。结果：成功筛选获得了一株产腺苷酸脱氨酶重组枯草芽孢杆菌WB600/pHY-AMPD,进一步在摇瓶中探究了发酵培养基成分对重组酶发酵的影响。获得了较优发酵培养基为：葡萄糖10 g/L、 酵母膏30 g/L、CaCl2 0.5 g/L、柠檬酸三钠1 g/L、NaH2PO4 10 g/L、K2HPO4 10 g/L、(NH4)2SO4 5 g/L,37 ℃、200 r/min发酵60 h摇瓶发酵液酶活力可达到（2 230±50） U/mL。结论：本研究实现了鼠灰链霉菌来源的腺苷酸脱氨酶基因在枯草芽孢杆菌中表达。     

枯草芽孢杆菌普鲁兰酶基因的分泌表达及其在粉丝制作中的应用

作者旨在研究枯草芽孢杆菌普鲁兰酶的分泌表达及表达产物的应用性能.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168菌株的普鲁兰酶编码基因BsP分别在大肠杆菌(Escherichia coli和枯草芽孢杆菌中进行表达,重组酶在两种宿主中均能利用自身结构分泌到细胞外.重组酶分泌到枯草芽孢杆菌细胞外的产物的酶学性质与积...     

枯草芽孢杆菌全细胞催化高效合成α-熊果苷

α-熊果苷是一种糖苷类化合物,有较好的抗炎、修复和美白作用。通过生物转化法合成α-熊果苷具有高效、绿色环保的特点。该文以枯草芽孢杆菌为宿主,以对苯二酚(hydroquinone, HQ)和蔗糖为底物,异源表达来源于变异链球菌(Streptococcus mutans)的蔗糖磷酸化酶(SmSP^I336L)作为生物催化剂,全细胞催化高效合成α-熊果苷。首先,通过对蛋白表达能力的比较确定了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800是合适的宿主菌株,并对SmSP^I336L进行启动子优化及多拷贝整合表达,获得全细胞催化合成α-熊果苷的重组B.subtilis,α-熊果苷的产量为54.05 g/L,底物HQ的摩尔转化率为43.7%;然后,通过优化SmSP^I336L的核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)序列显著提高了α-熊果苷的产量和底物HQ的摩尔转化率,分别达到99.14 g/L和80.15%;最后,对全细胞催化的条件进行优化,扩大催化体系至20 mL并将催化时间从22 h延长至3...     

重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌构建与表达

根据GenBank枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因序列设计引物,以枯草芽孢杆菌基因组为模板,PCR克隆α-淀粉酶基因(amy),将α-淀粉酶基因插入穿梭表达载体pP43C,构建重组质粒pP43Camy。随后将重组质粒转化八种蛋白酶缺陷的宿主枯草芽孢杆菌WB800,经筛选获得重组枯草芽孢杆菌α-淀粉酶基因工程菌WB800/pP43Camy1026,工程菌摇瓶发酵酶活力达960U。性质研究表明,重组α-淀粉酶的最适作用温度为70℃,最适反应pH为6.0,具有良好的应用潜力。     

一种中性普鲁兰酶的高效表达及重组酶在粉丝制作中的应用

为获得适合粉丝制作工艺的普鲁兰酶,研究了嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)普鲁兰酶基因Gs P在不同枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)宿主菌中的表达及重组酶的应用效果。分别以淀粉酶基因缺失的枯草芽孢杆菌1A717和蛋白酶基因缺失的菌株WB600为宿主菌,构建了表达Gs P的重组菌,酶活检测和SDS-PAGE分析表明,两种重组菌产生的普鲁兰酶均为胞外酶,分别命名为Gs P1a和Gs Pwb。两种重组酶分别用于粉丝制作,以Gs P1a处理的芡糊制作的粉丝成品断条率接近于0,由Gs Pwb处理的芡糊制作的粉丝断条率高于前者,这可能与宿主菌WB600在发酵过程中产生的α-淀粉酶有关。该研究表明,中性普鲁兰酶是粉丝制作中明矾的理想替代物,酶液中α-淀粉酶活性的去除有利于其应用性能的提升。     

土壤宏基因组中芽孢杆菌信号肽的克隆及分析

从土壤宏基因组中筛选获得在芽孢杆菌中高效分泌重组蛋白的信号肽。通过数据分析,将预测到的信号肽DNA片段与蛋白酶基因融合,在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）WB800和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）DL6中表达,进行胞外蛋白酶酶活测定。筛选得到25个可能来源于G+菌的信号肽序列,胞外蛋白酶活性分析的结果显示,有14个信号肽具有较好的分泌蛋白酶的能力,其中引导效果最好的信号肽（sig20）是蛋白酶自身信号肽的1.64倍。将高分泌信号肽转化到地衣芽孢杆菌中,证实其在地衣芽孢杆菌同样具有较好的引导效果。应用生物信息学与宏基因组学相结合的方法,可有效获得高效的芽孢杆菌信号肽序列,为蛋白质高效分泌表达系统的构建提供丰富的表达元件。     

大麦β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中异源表达

该研究拟采用枯草芽孢杆菌异源表达大麦来源β-淀粉酶。选择枯草芽孢杆菌WB800作为宿主,采用同源重组的方法构建表达载体p P4 3NMK-amy B,获得重组枯草芽孢杆菌WB-amy B。重组枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵条件下酶活最高可达386 U/m L,纯化后测得其比酶活为613 U/mg。重组酶的最适温度为55℃,最适p H值为5. 0。重组β-淀粉酶水解产麦芽糖能力与大麦β-淀粉酶相当,与普鲁兰酶联用时麦芽糖最大转化率可达81. 8%。重组枯草芽孢杆菌摇瓶发酵水平产酶量高于类似文献报道,重组β-淀粉酶的酶学性质与大麦β-淀粉酶相比几乎相同,完全可以替代大麦β-淀粉酶在工业上的应用。     

谷氨酰胺酶基因的克隆、表达和酶学性质研究

以枯草芽孢杆菌基因组为模板通过PCR扩增获得谷氨酰胺酶基因ylaM,构建重组质粒p MA5-ylaM,将其转化到枯草芽孢杆菌168中获得重组菌BS168/pMA5-ylaM,并在宿主菌成功得到表达,纯化后的谷氨酰胺酶比酶活大小为939.48 U/mg。谷氨酰胺酶的反应最适pH为7.5,反应最适温度为55℃,La~(3+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)和Al~(3+)对谷氨酰胺酶活力具有一定的抑制作用,在NaCl浓度为15%～17.5%的条件下,该酶酶活力可以保留50%以上。在5 L罐中,通过分批补料发酵,其最高酶活力产量为215.06 U/mL。     

麦芽糖α-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达

采用重叠PCR方法在麦芽糖α-淀粉酶编码基因5’端添加地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因信号肽编码区,获得重组基因BlMa。重组基因与芽孢杆菌表达载体pHY-P43连接后直接转化枯草芽孢杆菌,获得重组质粒pHY-P43-BlMa。枯草芽孢杆菌淀粉酶基因缺陷株1A717被用作BlMa基因表达宿主菌,重组菌命名为Bacillus subtilis/pHY-P43-BlMa。酶活检测和SDS-PAGE电泳均显示,B.subtilis/pHY-P43-BlMa表达的重组麦芽糖淀粉酶(BlMa)全部分泌到培养液中。HPLC检测表明,BlMa催化可溶性淀粉水解产物主要为麦芽糖。对B.subtilis/pHY-P43-BlMa摇瓶发酵条件进行优化。获得优化发酵培养基配方:10%玉米淀粉,2.5%药媒,0.3%(NH4)2SO4,0.03%CaCl2,0.1%NaH2PO4,在优化条件下重组菌发酵酶活为5.9 U/mL。