报告基因系统HSV1-sr39tk/FIAU监测治疗基因表达的体外研究

构建HSV1-sr39tk为报告基因,以VEGF165为治疗基因的重组腺病毒载体Ad5-sr39tk-IRES-VEGF165(Ad5-SIV),将其以不同感染复数(MOI=0、10、25、50、75、100)感染大鼠骨髓间充质干细胞,用免疫激光共聚焦技术检测HSV1-sr39tk与VEGF165的表达。用酶联免疫吸附试验(ELISA)监测感染病毒后细胞培养上清中VEGF165蛋白分泌量;细胞摄取131I-FIAU实验监测HSV1-sr39tk报告基因的表达情况,以腺病毒包装增强型绿色荧光蛋白(Ad5-EGFP)为对照。结果显示:免疫共聚焦显微镜可观察到HSV1-sr39tk蛋白与VEGF165蛋白在细胞内成功表达;VEGF165蛋白分泌情况与MOI间呈线性正相关(P0.05);感染Ad5-SIV后细胞对131I-FIAU摄取率增高与MOI间呈线性正相关(P0.05)。不同时间摄取实验结果显示:30-150min间细胞摄取率迅速增高,之后增高减慢,进入平台期。MOI相关摄取结果与MOI相关ELLISA结果具有较好相关性(P0.05)。Ad5-SIV经感染后可在大鼠骨髓间充质细胞中成功表达,并且治疗基因VEGF与报告基因HSV1-sr39tk的表达呈正相关,说明可通过报告基因HSV1-sr39tk监测治疗基因VEGF165的表达,为动物水平报告基因显像提供理论支持。     

辐射诱导p53腺病毒重组体转染对结直肠癌细胞周期的影响

以复制缺陷型重组腺病毒载体（AdCMV-GFP）为对照,用复制缺陷型p53重组腺病毒载体（AdCMV-p53）转染经0．5、1．0、2．0Gyγ射线照射的HT-29细胞,克隆形成法检测对细胞的抑制作用,流式细胞分析法检测细胞周期和细胞凋亡,探讨辐射诱导对AdCMV-p53转染p53突变型结直肠癌细胞（HT-29细胞系）细胞周期的影响。结果显示,0．5—1．0Gy辐射诱导明显增强40MOIAdCMV-p53转染对HT-29细胞的抑制。与AdCMV-p53转染对照相比,1d后,辐射诱导转染组G0／G1期细胞减少5％-15％,s期细胞增加2％-19％,2．0Gy辐射诱导80MOI AdCMV-p53转染组G2／M期细胞增加12％;3d后,0．5、1．0Gy辐射诱导40MOI AdCMV-p53转染组G2／M期细胞分别增加10%-13％。辐射诱导AdCMV-p53转染组细胞凋亡与辐射诱导剂量和AdCMV-p53转染剂量相关。以上结果表明,辐射诱导加速AdCMV-p53转染细胞由Go／G1期到S期的进程,促进S期阻滞和G2／M期阻滞发生。     

低剂量γ射线辐照对人淋巴母细胞基因表达转录谱的影响

为探讨低剂量电离辐射生物效应作用机制,本文研究了不同剂量单次辐照后,人淋巴母细胞基因表达转录谱的变化。采用0．1Gy、0．5Gy和1．0Gy剂量的γ射线照射人淋巴母细胞,未照射细胞为对照组。照射后4h提取细胞总RNA,用含有45033个基因的人类全基因组表达谱芯片检测分析。对差异表达基因进行层次聚类分析、基因本体论分析和通路分析,并用实时荧光定量PCR验证。结果表明,3个剂量组均上调表达的基因1330个,下调表达的基因1002个。基因表达量与吸收剂量相关的基因共18个,其中与剂量正相关的基因16个,负相关的基因2个。层次聚类分析结果表明,4个实验组中,0．1Gy和1．0Gy照射组差异表达基因相似程度最高。这些差异表达的基因涉及到多条通路,如细胞周期、p53信号通路、碱基切除修复、RNA转运和内质网蛋白加工等。实时荧光定量PCR检测结果表明,CASP9（caspase9）mRNA在照射后4h随吸收剂量表达变化与基因芯片检测结果一致。基因芯片筛选出的差异表达基因有助于阐明低剂量辐射生物效应作用机理,与辐射剂量相关的差异表达基因有可能成为低剂量辐射暴露的生物剂量计。     

腺病毒载体携带HSV1-TK报告基因感染BMSCs后摄取~(131)I-FIAU的实验研究

用内部核糖体进入序列(IRES)将报告基因单纯疱疹I型病毒胸苷激酶(HSV1-TK)和治疗基因脑源性神经营养因子(BDNF)连接,双启动子法将TK-IRES-BDNF与增强绿色荧光蛋白(EGFP)包装到重组腺病毒载体中,得到Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP,扩增、纯化、测定病毒滴度;以感染复数(MOI)为0、50、100、150、200、250感染体外培养的骨髓间充质干细胞(BMSCs),以重组腺病毒Ad5-EGFP为无效对照病毒。荧光显微镜下观察感染细胞的绿色荧光细胞阳性率。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测感染细胞增殖能力。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)诱导感染细胞向神经元细胞分化,显微镜下观察细胞形态变化。实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)和2-△△CT法分析两目的基因的相对表达量(CT)。观察感染细胞对131I-FIAU的摄取情况。重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP在MOI为150可高效感染BMSCs,感染细胞存活率98%,且保持良好的神经元细胞诱导分化能力。RQ-PCR检测两目的基因随着腺病毒MOI增加表达增强,且TK和BNDF两基因的表达有良好的线性相关(r=0.973,P0.05,n=3)。在前3h可见感染目的基因组细胞对131I-FIAU的摄取程度与时间呈正相关,3h感染目的基因组对131I-FIAU摄取率可达(31.42±0.46)%(n=3),随后增加不明显。各点感染目的基因组摄取率均显著高于对照组(t=23.06–173.83,P0.05,n=3)。重组腺病毒载体能高效、低毒感染BMSCs,IRES介导两目的基因表达有良好的线性相关。本研究表明感染目的基因细胞可有效介导HSV1-TK摄取131I-FIAU,为后续放射性核素报告基因活体显像示踪转基因BMSCs治疗脑梗死提供了细胞水平依据。