采用全基因组改组技术选育蛋白酶高产菌株

为了提高枯草芽孢杆菌B4的蛋白酶产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育,先通过紫外诱变构建了B4菌的突变体库,在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4株诱变菌株(BRS1、BRS2、BRS5、BRS6)作为亲本,采用PEG介导的方法进行两次多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,共筛选出3株酶活力大幅度提高并能稳定遗传的优良菌株,为BRS1、BRS5、BRS6,酶活力最高达2175.81U/mL,达到原始菌株的3.01倍。     

基因组改组快速提高谷氨酸棒杆菌L-鸟氨酸产量

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为出发菌,应用基因组改组技术快速提高L-鸟氨酸产量。经过紫外线、亚硝基胍和甲基磺酸乙酯分别诱变处理,获得6株产量有所提高的突变株,以此构建用于基因组改组的候选菌库。考察培养基成分对原生质体再生率的影响。经过两轮的灭活原生质体递推式融合,以磺胺胍和氟化钠为双抗性筛选标记,共筛选出2株遗传性能稳定的改组菌株。其中改组菌株F2-6摇瓶发酵72h,积累L-鸟氨酸产量为2.99g/L,是出发菌株的13.6倍。结果表明基因组改组技术能够在短期内使谷氨酸棒杆菌的L-鸟氨酸产量得以提高。     

酱香大曲中链霉菌菌株FBKL4.005全基因组测序及序列分析

链霉菌FBKL4.005是本课题组前期从酱香大曲中分离得到的1 株耐高温菌株,能够在37～55?℃的范围内生长代谢,为了能够更深入地探究该菌株在酿酒过程中的代谢机理和功能性作用,完成大曲极端微生物开发应用,对于菌株的序列信息进行解析是最为全面高效的方式。本研究采用Illumina HiSeq 2000测序平台对菌株FBKL4.005进行全基因组测序,共得到67?771?429?个reads,2.47?G的数据量,通过对测序数据进行拼接,得到69?个contigs,菌株整个基因组大小为9?454?406?bp,GC含量为73.03%,经过滤处理后得到7.33?Mb的有效数据量及7?946?个注释基因,并通过GO、COG、KEGG、NR、TCDB数据库的比对分析,完成菌株基因组预测与基本功能的注释,获得的基因注释信息为今后深入开展酱香大曲中耐高温特性链霉菌类群代谢途径及机理的研究提供了理论支持。     

应用基因组改组选育耐糖L-乳酸高产菌株

本研究应用基因组改组提高鼠李糖乳杆菌的耐糖能力,进而提高L-乳酸的产量。通过紫外线和亚硝基胍诱变方法获得8株改良出发菌株。考察了氨基酸前处理和变溶菌素对原生质体形成的影响。利用双亲灭活的原生质体进行递进式融合,经过两轮基因组改组和碳酸钙高糖平板及瓶筛选,选育出了耐糖改组菌株F2-2。在初糖浓度为150g/L发酵罐中,F2-2的乳酸产量为140g/L,是野生型乳杆菌的1.8倍。结果表明基因组改组技术能够快速提高乳酸菌耐糖和产酸能力两个表型。     

微生物菌种选育中基因组重排技术应用的研究进展

基因组重排(genome shuffling)技术是通过传统诱变育种结合原生质体融合技术开发出的一种新型微生物菌种选育和改良技术,具有易操作、效率高和适用广等特点。本文对基因组重排技术的原理、操作过程及其在增加次生代谢产物产量、增强菌株耐受性和提高底物利用能力等方面的应用进行了综述。     

基于基因组改组技术选育多重抗性乙醇酵母

本文通过基因组改组（Genome shuffling）技术将酵母菌株的多重耐受性能集中于同一菌株,从而选育出多重抗性的乙醇酵母。以分别经过热灭活和紫外灭活的酵母GZ-0533、GZ-241、GZ一-582为亲本菌株,经过3轮基因改组后,筛选得到的28株酵母菌。第二次改组得到的MSR14和第三次改组得到的MSR23对多重胁迫条件的耐受性提高最多,乙醇产量分别达到8．58％和8．86％,较多重抗性最好的出发菌GZ-05相对提高了7％和10．5％。26SrDNA序列分析表明,MSR14和MSR23的26SrDNA序列与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源性为100％,均认定为酿酒酵母。     

基因组改组技术对L-乳酸产生菌耐热性的影响

采用紫外线与亚硝基胍(NTG)两种诱变方法获得用于基因组重组的出发菌株,应用灭活的多亲原生质体再融合获得活性融合子的方法,有效地提高了基因组改组后的筛选效率.采用低pH值平板和碳酸钙平板连续筛选的方法,筛选得到干酪乳杆菌改组菌株,具有较强耐酸性能,够在pH3.6 MRS平板上生长繁殖,产酸量为原始菌株的3.4倍,发酵温度提高到40℃,摇瓶发酵结果表明,改良菌株的代谢途径未发生变化.     

链霉菌L2001利用农业废弃物产木聚糖酶条件及酶解产物

本文主要研究产木聚糖醇的菌株对农业废弃物的利用情况并分析酶解产物.对本实验室保藏的木聚糖酶高产菌株进行筛选,其中链霉菌L2001能够较好地利用农业废弃物.通过单因素试验确定最佳碳源、氮源、温度、初始pH等.采用响应面Box-Benhnken中心组合试验设计优化链霉菌L2001产木聚糖酶的条件,同时建立木聚糖酶活力随碳源浓度、pH和温度变化的二次回归方程.结果表明,最佳发酵条件是:棉籽壳3.08%,pH6.48,温度40.1℃.在此条件下,木聚糖酶活力达498.8 U/mL.通过薄层层析分析链霉菌L2001产木聚搪酶的水解产物主要是木二糖和木三糖.     

传统诱变与基因组重排技术相结合选育耐高温酿酒酵母菌株

以酿酒酵母AY12为出发菌株,采用传统人工诱变育种与基因组重排技术相结合的方法选育出耐高温且高产乙醇的酿酒酵母菌株.通过将出发菌株进行紫外诱变,获得酿酒酵母突变群体,并从中筛选出耐高温且高产乙醇的23株突变株作为正向突变文库;将该文库通过酵母高效产孢与杂交反应实现突变文库的全基因组重排,筛选得到的基因组重排最优菌LYQ-F1的高温耐受性较出发菌株AY12明显提高,且在高温模拟发酵工艺中其乙醇产量较出发菌株提高了22.1％.     

基因改组选育高产杆菌肽地衣芽孢杆菌及改组菌株差异分析

为了提高地衣芽孢杆菌肽产量,采用全基因组改组技术进行菌株选育。以地衣芽孢杆菌TJ12为原始菌株,通过紫外诱变、亚硝基胍诱变、常压室温等离子体诱变构建了TJ12菌的突变体库。在优化其原生质体制备和再生条件的基础上,以其中4 株诱变菌株（U11、U23、H1、L71）作为亲本,采用聚乙二醇介导的方法进行3 轮多亲本的全基因组改组,同时,结合双亲灭活的筛选方法,最终选出1 株杆菌肽产量提高并能稳定遗传的优良菌株F3,对其摇瓶发酵36 h,杆菌肽A产量达760 mg/L,为野生菌株TJ12的1.7 倍。与野生菌株TJ12相比,改组菌株提前进入生长稳定期,两者发酵过程pH值几乎无差异;最终改组菌生长量虽低于野生菌,但菌株单位细胞还原糖产量及杆菌肽产量都高于野生菌株;其合成基因和调控基因表达量相对野生菌株都上调,其中合成基因上调幅度较大。推测改组菌株自身有了更强大的杆菌肽耐受机制,且合成基因相关部位可能发生了改变。     

Production,Characterization and Application of a Xylanase from Streptomyces sp. AOA40 in Fruit Juice and Bakery Industries

Streptomyces sp. AOA40, which produces halotolerant and thermotolerant xylanase, was isolated from Mersin soil. Various carbon sources were tested for xylanase production with selected fermentation medium. The best carbon source was selected as corn stover. The effect of corn stover concentration and particle size, composition of fermentation medium, fermentation condition such as initial pH and agitation rate on xylanase production was determined. After production, xylanase was partially purified with ion-exchange chromatography and gel filtration chromatography for characterization of xylanase and application in fruit juice and dough improvement. The optimum pH for the activity of xylanase occurred at pH 6.0 in phosphate buffer, while the optimum temperature was 60°C. The relative xylanase activity in the pH ranges of 4–9 remained between 59.93 and 54.43% of the activity at pH 6.0 (100.00%). The xylanase activity showed a half-life of 172 min at 70°C, which was reduced to 75 min at 80°C. The enzyme was highly inhibited by 10–100 mM of Hg⁺², EDTA, Mg⁺², SDS and 100 mM Cu⁺². Clarity of fruit juices increased after enzymatic treatment of apple (17.85%), grape (17.19%) and orange juice (18.36%) with partially purified xylanase and also reducing sugar concentrations of these fruit juices were improved by 17.21, 16.79 and 19.57%, respectively. Also, dough volume was raised 17.06% with using partially purified Streptomyces sp. AOA40 xylanase in bread making.     

在明串珠菌中构建葡萄糖到甘露醇的转化体系

为了进一步提高甘露醇产量,在明串珠菌构建了葡萄糖到甘露醇的转化体系。通过2次同源重组,将mt1d-m1p表达盒串联体定点插入到染色体上。以90 g/L蔗糖为底物时,野生型菌株的甘露醇产量为31. 48 g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)为42. 63 g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::amy为43. 47 g/L,Δaldh::(mt1d-m1p)Δdts::(mt1d-m1p)为45. 74 g/L,Δdts1ΔD-ldhΔpat::mdhΔstpk::mdhΔfk::mdhΔaldh::(mt1d-m1p)为47. 26 g/L。增加甘露醇的合成途径是增产的手段之一。     

Methylopila sp. YHT-1鉴定及其发酵产吡咯喹啉醌

以甲醇为唯一碳源,从土壤中筛选分离出一株分泌吡咯喹啉醌(PQQ)菌株YHT-1。通过形态学特征、生理生化特征和16S r RNA基因序列分析,鉴定为Methylopila sp.菌。经摇瓶发酵初步优化后,YHT-1在3 L发酵罐中发酵4 d,PQQ产量达113.6 mg/L。发酵产物经DEAE阴离子交换初步纯化、低温结晶,得到PQQ粗品,并经HPLC和紫外光谱分析,证实为PQQ。     

足球菌ISK—1的发酵产物足球菌素ISK—1的生产最适化

研究了足球菌ＩＳＫ－１发酵中温度，ｐＨ值以及无机阳离子对足球菌素ＩＳＫ－１活性的影响，３７℃，ｐＨ值为５．５～６．０是产生足球菌素ＩＳＫ－１的较适宜条件，Ｍｎ＾２＋和Ｍｇ＾２＋对足球菌素ＩＳＫ－１的产生是必需要，而Ｎａ＾＋，Ｃａ＾２＋，ＮＨ４等阳离子均能提高足球菌素ＩＳＫ－１的活性，其中以Ｎａ＾＋的效果最显著。     

基因组改组技术及其在工业微生物改良中的应用

基因组改组技术是一种以原生质体融合为手段,实现多基因组重组的育种策略。文中从基因组改组基本原理出发,以相关研究成果为基础,系统介绍了基因组改组的策略与方法,并对该技术未来发展方向予以展望。     

链霉菌9-1-1产几丁质酶的发酵条件研究

从烟草根际土样中分离、筛选得到1株几丁质酶活性比较高的链霉菌9-1-1,为评价该菌株利用价值,对其发酵条件(碳源、氮源、初始pH、表面活性剂及发酵时间)进行了研究.结果表明:该菌株的最佳发酵条件以1%胶体几丁质为碳源,发酵液初始pH值为6.5,以1%蛋白胨为氮源,0.1%吐温80作为表面活性剂,发酵时间为96 h,接种量为1%,最高酶活达到56 U/mL.     

一株产低温纤维素酶放线菌的分离与产酶研究

用羧甲基纤维素钠-刚果红培养基从内蒙大青沟采集的森林土壤中分离了一株产纤维素酶的耐低温菌,命名为ND2-1,其形态和16S r DNA序列分析结果表明ND2-1为链霉菌属（Streptomyces sp.）的放线菌。ND2-1能在10³5℃范围内生长,最适生长温度为25℃,属耐低温菌。滤纸崩解实验表明,ND2-1能高效降解纤维素。ND2-1在25℃条件下,在含有2 g/L羧甲基纤维素钠（CMC-Na）的培养基中培养3 d后酶活性最高。对其酶学性质的初步研究结果表明:该菌株所产纤维素酶在p H3.0⁹.0范围内稳定,且酶活性都较高,最适反应p H为7.0;最适反应温度为30℃,K+和Cu2+对酶活有抑制作用,Mn2+能提高相对酶活性至166.7%。      

Bioconversion of 1-adamantanol to 1,3-adamantanediol using Streptomyces sp. SA8 oxidation system

To efficiently produce 1,3-adamantanediol (1,3-ad(OH)₂) from 1-adamantanol (1-adOH), our stocks of culture strains and soil microorganisms were surveyed for hydroxylation activity towards 1-adOH. Among them, the soil actinomycete SA8 showing the highest hydroxylation activity was identified as Streptomyces sp. based on 16S ribosomal DNA sequence analysis. The reaction products were purified by silica gel column chromatography, and from NMR and MS analyses, they were identified as 1,3-ad(OH)₂ and 1,4-ad(OH)₂. Streptomyces sp. SA8 produced 5.9 g l^? 1 1,3-ad(OH)₂from 6.2 g l^? 1 1-adOH in culture broth after 120 h at 25 °C. Using resting cells, 2.3 g l^? 1 1,3-ad(OH)₂ was produced after 96 h of incubation at a 69% conversion rate. In both cases, 1,4-ad(OH)₂ was formed as a byproduct at a rate of about 15%. Strain SA8 also hydroxylated 2-adamantanol and 2-methyl-2-adamantanol.