丙酮酸脱氢酶竞争性抑制剂调控裂殖壶菌脂肪酸合成的研究

本研究以合成乙酰辅酶A的丙酮酸脱氢酶复合体为扰动目标,通过应用底物特异竞争抑制剂——氟化丙酮酸(FP)来扰动乙酰辅酶A的合成,在考察扰动后裂殖壶菌的碳消耗、菌体生长、油脂合成、脂肪酸成分的基础上,分析了工业生产二十二碳六烯酸(DHA)菌株——裂殖壶菌中的乙酰辅酶A在普通脂肪酸合成途径(FAS途径)和类聚酮合酶途径(PKS途径)的分配比例变化。结果发现裂殖壶菌可转化利用FP;1 mmol/L FP在抑制总油脂合成的同时也显著改变了乙酰辅酶在FAS和PKS途径中的分配比率;降低了生物质合成,增强了二氧化碳生成量。表明裂殖壶菌的FAS途径对乙酰辅酶A的亲和力可能高于PKS途径;通过降低乙酰辅酶A供给量并不能提高总脂肪酸中多不饱和脂肪酸(DHA和DPA)的含量。这一结果解释了FAS途径和PKS途径的碳流分配调控机制,对于选育DHA高产菌株以及工业发酵过程优化具有重要意义。      

丙酮酸对Bacillomycin D合成的影响及调控

目的:本文主要研究外源添加丙酮酸和过表达丙酮酸激酶（pyk）、乙酰辅酶A合成酶（acs）对Bacillomycin D合成的影响及调控作用。方法:本研究以B.amyloliquefaciens fmbJ为出发菌株,首先通过HPLC检测了外源添加不同浓度的丙酮酸对Bacillomycin D产量的影响,并通过RT-PCR检测了丙酮酸在此过程中的调控作用。然后通过电转化的方法构建了丙酮酸激酶和乙酰辅酶A合成酶的诱导型过表达菌株B.amyloliquefaciens fmbJ-pyk、fmbJ-acs,并研究了二者在不同浓度IPTG诱导下的Bacillomycin D产量。结果:0.075%的丙酮酸可将Bacillomycin D产量提高至对照组的1.41倍,Bacillomycin D合成基因的上调也证实了这一提高作用。此外,丙酮酸能够上调comA、comP、comQ、sigH、sigM、degU、degQ、spo0A、codY等调控因子的表达,下调rapC和abrB的表达,并促进乙酰辅酶A合成酶的表达,最终共同促进Bacillomycin D的合成。在50 mg/L的IPTG的诱导下,fmbJ-acs和fmbJ-pyk的Bacillomycin D产量也分别提高至fmbJ的1.16和1.34倍。结论:本研究发现外源添加丙酮酸以及过表达丙酮酸激酶和乙酰辅酶A合成酶可以促进Bacillomycin D的合成,揭示了丙酮酸在Bacillomycin D合成中的调控作用,为推进Bacillomycin D高效生产提供了新的研究思路。     

发酵法生产丙酮酸的研究进展

本文简要综述了发酵法生产丙酮酸的菌种选育、发酵调控策略、提取及分离纯化等方面的研究进展。     

脂肪酸脱氢酶研究进展

脂肪酸脱氢酶（Fatty Acid Desaturases）是多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fattyacids，PUFAs）合成途径关键酶，催化脂肪酸链上特定位置形成双键。PUFAs参与构成生物膜，对生物膜的形成和物理性质、膜脂中脂肪酸的组成与不饱和度等方面起主要调节作用。脂肪酸脱氢酶可分为Acyl—CoA、Acyl—lipid和Acyl—ACP3类，又可分为可溶性脱氢酶和膜结合脱氢酶，其中膜结合脱氢酶又有羧基定向脱氢酶和甲基定向脱氢酶之分。脂肪酸脱氢酶结构上都有3个组氨酸保守区，羧基定向脱氢酶N端还有一个类似Cyt b5的血红素结合区。近年来脂肪酸脱氢酶的相关研究成为热点，本文概述了几种主要脂肪酸脱氢酶的分子生物学研究情况。其中，利用基因工程手段来获得高产PUFAs产量的工程菌株或油料作物来生产特定PUFAs有极大应用前景。     

不同破壁方法对丙酮酸激酶活性的影响

目的研究4种不同处理方法对纤维堆囊菌中丙酮酸激酶酶活性的影响。方法分别采用液氮研磨法、石英砂研磨法、超声波法和溶菌酶法将纤维堆囊菌细胞破壁,然后分别测定丙酮酸激酶的酶活性,比较酶活性及操作难易度。结果石英砂研磨条件下酶活性最小,超声波破碎和液氮研磨酶活性相近,溶菌酶法最高;溶菌酶法耗时间最长,其他3种相近。结论超声波破碎法成本低,效率高,是首选的方法。     

乳酸菌中乳酸脱氢酶的研究进展

乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenases,LDHs)是乳酸菌利用碳源转化丙酮酸为乳酸的关键酶。本文从乳酸脱氢酶的分类、结构与功能、合成乳酸的微生物属别及代谢途径等方面,综述了乳酸菌中乳酸脱氢酶的研究进展,以期为微生物合成乳酸的代谢调控提供一定的理论指导。      

冰温对鸡胸肉成熟过程中品质的影响

为研究冰温对宰后鸡胸肉成熟过程的影响,本研究以白羽鸡鸡胸肉为原料,对比冷藏(4℃)和冰温(-1.5℃)状态下鸡胸肉在成熟过程中pH、剪切力、乳酸以及糖酵解过程限速酶丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶活力的变化。结果表明,冰温状态延缓了乳酸积累,剪切力和pH极限值的到达时间,并且延迟了糖酵解过程中关键酶丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的活力,与冷藏状态的鸡胸肉相比,冰温状态下鸡胸肉的最低pH被延缓了6 h,乳酸的积累延缓2 h,剪切力的最大值延迟了2 h,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶活力最大值被延迟了2 h,冰温可以延缓鸡胸肉成熟进程大约2~6 h,但在冰温和冷藏状态下各项指标的变化趋势相同,除乳酸脱氢酶外其余各项指标的极限值均无显著性差异(p>0.05)。     

木糖醇脱氢酶研究进展

综述了木糖醇脱氢酶研究现状,包括木糖醇脱氢酶的提取、结构、理化性质以及辅酶改造,同时对利用生物技术进行木糖醇脱氢酶基因克隆和表达的研究概况进行了简要介绍。     

酿酒酵母pdc基因缺陷菌株的构建及其丙酮酸发酵特性

丙酮酸是一种重要的有机酸,在聚合物、化妆品、食品添加剂、医药等领域具有广泛应用。酿酒酵母被认为是丙酮酸生产的潜在最适微生物,但其糖酵解过程产生的丙酮酸会在胞质内的丙酮酸脱羧酶催化作用下降解为CO₂和乙醛,造成碳代谢流的损失。为将更多的碳代谢流引向丙酮酸合成,该研究通过敲除丙酮酸脱羧酶的3个结构基因(pdc1、pdc5和pdc6),显著地促进了丙酮酸积累,但也造成突变菌株XY-156生长缓慢。与进化之前相比,采用适应性进化策略驯化得到的菌株XY-156A,在细胞生长、葡萄糖消耗以及丙酮酸积累方面均获得显著提高;进一步利用2 L发酵罐进行批次补料发酵试验,发酵76 h丙酮酸产量可达105 g/L,生产强度为1. 38g/(L·h),得率为0. 5 g/g葡萄糖。结果表明,采用失活丙酮酸脱羧酶与适应性定向进化相结合的策略改造酿酒酵母,能够实现其高效积累丙酮酸,可为生物基丙酮酸工业化生产奠定坚实的基础。     

白酒大曲微生物酶系研究进展

大曲既是大曲酒生产的重要物质基础,也是我国最早、最原始的粗酶制剂。 大曲具有糖化、发酵、酒化和生香等功能,不但为 大曲酒的发酵、成香提供必不可少的微生物菌群和风味前驱物,还提供发酵所必须的丰富的生物催化剂-酶类。 随着对大曲中微生物 功能、微生物与酶关联地深入研究,使大曲酶系的重要性逐渐凸显出来。 大曲中各类酶系的特点与功能,不仅影响着大曲酒的出酒 率,也赋予各类大曲酒独具个性的酒体风格,更是决定大曲酒品质的重要因素。该文主要对不同大曲菌系与酶系关系进行概述,着重 介绍大曲主要功能酶的分类、作用、来源以及应用研究情况,以期为大曲菌系、酶系的深入研究打下基础。     

亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶共表达菌株发酵产酶条件优化及其在L-2-氨基丁酸合成中的应用

亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸生成L-2-氨基丁酸需要辅酶NADH参与,构建Escherichia coli (Leu DH/FDH),通过共表达亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶实现了辅酶NADH胞内循环再生。通过产酶条件优化,提高该菌株催化制备L-2-氨基丁酸的效率。结果表明,在5 L发酵罐上,在诱导温度为22℃、诱导剂乳糖质量浓度为8. 0 g/L和诱导时间为17 h的条件下,亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的酶活分别达到79. 2 U/g和216. 1 U/g,催化效果最佳。利用该菌株全细胞为催化剂,耦合苏氨酸脱氨酶,在1 L反应体系中进行了催化反应,L-苏氨酸质量浓度为180 g/L时,无需额外添加辅酶,8 h反应后底物转化率达到99%,L-2-氨基丁酸e. e.值99. 5%以上,时空产率19. 3 g/(L·h)。该研究为建立高效、低成本的L-2-氨基丁酸工业化生产方法提供了基础。     

丙酮酸改性壳聚糖的制备及应用

利用壳聚糖C2位上活泼氨基与丙酮酸进行席夫碱反应,制取丙酮酸改性壳聚糖(简称为PCTS)。实验结果表明其最佳的合成条件为:1.8g溶胀的壳聚糖与1.48g丙酮酸在pH=4～5反应4h后,加入1.7g NaBH4反应1.5h,合成的1.6g PCTS,取代度可达88.14%。结果显示0.1g的PCTS吸附0.1g/L的Cu(Ⅱ)和Zn(Ⅱ),其吸附率分别可达100%和99.29%;PCTS对NO2也有一定的清除作用,11mg/ml的取代度为85.79% PCTS对NO2的清除率可达50.57%。     

丙酮酸发酵液脱色工艺的研究

研究了粉末活性炭、K-15颗粒活性炭和732阳离子树脂等三种脱色剂对丙酮酸发酵液的脱色条件、脱色效果及其对丙酮酸的吸附程度。结果表明,732阳离子树脂是理想的脱色剂,具有脱色、沉淀蛋白质和去除钠离子三种功用。确立丙酮酸发酵液的脱色工艺为:离心发酵液阳离子柱脱色和改性发酵液后续工序,减少了离交法提取丙酮酸的环节,增加丙酮酸提取的收率。     

重组葡萄糖脱氢酶的酶学性质及其偶联辅酶再生

为解决生物催化氧化还原反应中辅酶循环问题,人工合成密码子优化后的嗜酸热源体Thermoplasma acidophilum葡萄糖脱氢酶基因Sygdh,于E.coli BL21(DE3)中表达,粗酶液经镍柱亲和层析获得纯化的重组葡萄糖脱氢酶SyGDH。SDS-PAGE显示相对分子质量为41.0 kDa。酶学性质分析表明:该酶的最适pH值为7.5,在pH 6.0~8.0稳定;最适反应温度为40℃,在55℃以下稳定;最适条件下其比活性达4.5 U/mg;Zn2+对其有明显激活作用;该酶对NADP+的亲和力大于NAD+且对大多数有机溶剂有良好的耐受性;对D-葡萄糖的Km和Vmax值分别为28.2 mmol/L和6.5 U/mg。在葡萄糖脱氢酶与羰基还原酶偶联构建的NADPH辅酶循环体系中,以4-氯乙酰乙酸乙酯为底物,羰基还原酶催化产物4-氯-3-羟基丁酸乙酯的产率为99.0%,是未添加葡萄糖脱氢酶时产物产率的3.11倍,表明重组SyGDH具有为生物催化氧化还原反应提供辅酶NADPH再生的能力。     

重组葡萄糖脱氢酶酶学性质研究

葡萄糖脱氢酶可用于高纯度低聚果糖和葡萄糖酸钙的生产，一种重组葡萄糖脱氢酶表达、纯化后，对该酶酶学性质进行了研究。最适反应pH值8．4，最适反应温度37℃，在温度低于45℃条件下，酶活力稳定性好。在最适温度和pH条件下，以葡萄糖为底物时葡萄糖脱氢酶的米氏常数Km=20．09mmol／L，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）为底物时的米氏常数Km=0．10mmol／L。     

不同代数啤酒酵母对胞内代谢关键酶活性的影响

对不同代数啤酒酵母在丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乙醇脱氢酶的酶活性特征方面的差异进行了比较分析,发现酵母在不断传代过程中,胞内代谢关键酶的活性均呈现一定变化,而丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和乙醇脱氢酶变化最为明显,并且与酵母活力有着紧密的联系,当3种酶活性高时,酵母活力旺盛,代谢物质的量较为协调.     

镁、钼对野油菜黄单胞菌代谢关键酶的影响

野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)是一种利用碳水化合物为主要底物发酵产生酸性胞外杂多糖黄原胶的革兰氏阴性菌。本实验研究了通过添加不同浓度的Mg2+、MoO2-对野油菜黄单胞菌代谢过程中关键酶:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,丙酮酸激酶在不同发酵时期的活性变化。结果表明,Mg2+添加量为1ml即在发酵液中为0.5g/50ml时葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性明显提高,MoO2-在发酵液中浓度为0.20g/50ml时丙酮酸激酶活性提高,表明适量的镁、钼对上述酶活性有调控作用。     

白酒大曲功能微生物与酶系研究进展

中国白酒有着悠久的历史,是世界著名六大蒸馏酒之一。酒曲是我国白酒必不可少的发酵剂,为白酒发酵提供必要的糖化力、酒化力和风味前体,并承载着发酵的启动和顺利进行所必需的微生物菌群和各类功能酶系。作为影响白酒品质、类型和风格的粗酶制剂,众多研究都聚焦于揭示酒曲中微生物和相关酶系的功能、作用和类群的奥秘。该文从酒曲原料、制作、发酵、成熟等工艺过程出发,阐述各工艺过程的要求和特点,分析酒曲发酵和成熟过程中各类微生物类别和作用,以及多种酶系的功能,并在此基础上对大曲微生物、酶系和白酒酿造研究方面提出展望。     

添加游离丙酮酸对黄单胞杆菌产黄原胶中丙酮酸功能基团含量的影响

在发酵过程中添加游离丙酮酸可以比较明显地提高所产黄原胶分子中丙酮酸功能基团的含量，实验研究表明，添加3．0g/L的游离丙酮酸可以使黄原胶分子中丙酮酸功能基团的含量由4．74％提高到5．29％，提高11，6％，且不影响黄原胶的产胶率，达到33．9g／L。同时通过实验得到游离丙酮酸的最佳添加时间为发酵开始后24h。