LHRH-PE40对宫颈癌细胞株细胞周期及Ki-67、Bcl-2的影响

目的观察LHRH-PE40对宫颈癌Hela细胞系凋亡及增殖的影响,为其临床应用提供理论依据。方法采用人宫颈癌Hela细胞株进行培养,在培养液中分别加入不同浓度的LHRH-PE40,作用48h后,观察Hela细胞形态的变化,并通过结晶紫染色法检测宫颈癌Hela细胞株对LHRH-PE40的感受性;用流式细胞仪及免疫组化法检测LHRH-PE40对Hela细胞周期、Ki-67及Bcl-2的影响。结果LHRH-PE40对Hela细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性,通过量效曲线可以看出,LHRH-PE40的最小有效剂量为0·625μg/ml;半数致死剂量为0·969μg/ml。在1·0μg/ml浓度下,癌细胞中的Ki-67阳性细胞(用药前80%,用药后42%)及Bcl-2阳性细胞(用药前66%,用药后43%)比率均下降,凋亡细胞比率增加(由0增加到3·7%)。在1·0μg/ml浓度下,细胞的G0/G1期细胞比率增加15·21%;S期细胞变化不大,而G2/M期减少38·28%。结论LHRH-PE40可以有效地抑制宫颈癌细胞的增殖,诱发肿瘤细胞凋亡,是一种很有应用前景的抗肿瘤药物。     

LHRH受体在喉癌组织中的表达及其在喉癌HEp-2细胞膜表面与LHRH-PE40的亲和力

目的探讨人促黄体激素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH)受体在喉癌组织中的表达及其在喉癌HEp-2细胞膜表面与LHRH-PE40的亲和力。方法取外科手术收集的50份喉鳞癌及20份癌旁组织标本,采用Western blot法检测LHRH受体的表达,免疫荧光分析法检测LHRH受体的亚细胞定位,ELISA法检测HEp-2细胞膜表面LHRH受体与LHRH-PE40的亲和力。结果 LHRH受体在喉癌组织中的表达量明显高于癌旁组织(P0.001);LHRH受体在喉癌组织中定位于细胞膜和细胞质,而在癌旁组织中定位于整个腺体周边;LHRH受体在HEp-2细胞膜表面与LHRH-PE40的结合显示出线性和饱和性,且可被LHRH直接特异性抑制。结论 LHRH受体在喉癌组织中的过度表达及其在喉癌细胞表面与LHRH-PE40的高亲和力表明,其可能是LHRH-PE40的一个潜在的治疗靶点。     

LHRH-PE40对黑色素瘤A375细胞的诱导凋亡作用

目的 研究促黄体激素释放激素-绿脓杆菌外毒素(Luteinizing hormone releasing hormone-Pseudomonas aeru-gionosa exotoxin 40,LHRH-PE40)对黑色素瘤A375细胞的诱导凋亡作用。方法用LHRH-PE40处理A375细胞,透射电镜观察细胞结构的改变;DNA ladder和流式细胞仪检测细胞的凋亡。结果经LHRH-PE40作用后,透射电镜观察可见A375细胞核聚集于一侧;DNA ladder检测发现,A375细胞的DNA电泳图像呈梯形条带;流式细胞术检测结果显示,A375细胞出现明显的二倍体峰,细胞周期也发生了相应的改变。结论 LHRH-PE40对A375细胞的细胞毒性作用可以有效诱导A375细胞凋亡。     

LHRH-PE40与癌细胞表面LHRH受体结合特性的检测

目的检测LHRH-PE40融合蛋白是否保留了LHRH与癌细胞表面其相应受体特异性结合的性质。方法在Hela细胞培养液中,分别加入LHRH和LHRHPE40,经结晶紫染色法检测A值。另取宫颈癌组织切片,分别加LHRH-PE40和LHRH后,再加兔抗PE40血清和羊抗兔IgG异硫氰酸荧光素,在荧光显微镜下观察荧光强度。结果随着LHRH与LHRHPE40的摩尔数之比由100/1、250/1增加到500/1,细胞毒性的效果逐渐减弱。当LHRH/LHRH-PE40达到500/1时,肿瘤细胞表面的LHRH受体饱和;LHRH/LHRHPE40达750/1时,其A值与500/1时的A值接近。宫颈癌组织加入LHRH竞争后,荧光强度较仅加LHRHPE40组明显减弱。结论重组毒素LHRH-PE40仍保留了与癌细胞LHRH受体结合的特性。     

抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素基因的克隆与表达

目的扩增抗癌胚抗原单链抗体(CEA-ScFv),与绿脓杆菌外毒素(PE40)进行重组及原核表达,旨在进一步研究重组蛋白CEA-ScFv-PFA0的靶向抗肿瘤作用。方法分别扩增抗癌胚抗原单链抗体的重链区、轻链区,用overlap PCR按照VH-VL的顺序连接,克隆至pMD18T载体中。再将VH-VL基因片段与含有.PE40的表达载体pET28a连接,转化B121(DE3),IPTG诱导表达。结果经DNA测序,其结果与设计完全相符。SDS-PAGE分析,在相对分子质量66000处可见明显表达带,表达量可占菌体蛋白总量的13％以上。免疫印迹表明重组蛋白具有PF40的抗原特异性。结论抗癌胚抗原单链抗体-PE40免疫毒素的成功克隆与表达,为进一步研究其生物活性奠定基础。     

促黄体激素释放激素及其靶向毒素

促黄体激素释放激素受体可以作为某些恶性肿瘤细胞的靶标。促黄体激素释放激素(LHRH)的结合位点在人乳腺癌、卵巢和子宫内膜肿瘤以及前列腺癌细胞的中均有较高表述,而在人的正常组织中少有表达,因此成为一种有效的恶性肿瘤特异性受体。LHRH重组毒素能有效抑制接种LHRH受体阳性肿瘤的裸鼠肿瘤生长。本文对LHRH及其受体和靶向毒素的研究进展作了较全面的综述。     

IL-2与绿脓杆菌外毒素A嵌合蛋白的研究

目的获得ＩＬ－２绿脓杆菌外毒素Ａ嵌合蛋白,用于相关疾病的治疗。方法用ＰＣＲ方法扩增分 离ＩＬ－２和ＰＥＡ的基因,将ＩＬ－２基因的３’端与绿脓杆菌外毒素Ａ基因的５’端连接后克隆至ｐＢＶ２２０上,转化大肠杆菌 ＤＨ５ａ。挑取菌落培养,快速提取质粒进行酶切,并在温控条件下表达。结果经鉴定,获得重组质粒ｐＢＶ／ＩＬ－２／ ＰＥＡ。温控诱导表达后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,在５１ ０００处有蛋白表达带。以鼠抗人ＩＬ－２单克隆抗体经免疫印迹验 证,该表达蛋白为所设计的嵌合蛋白。结论本研究建立了一种制备ＩＬ－２／ＰＥＡ嵌合蛋白的方法,该方法也可用于 表达其他蛋白。     

EGF-PE35KDEL重组毒素的基因构建及表达

目的　构建表达有特异细胞毒性融合蛋白的工程质粒。方法　利用PCR扩增出PE3 5KDEL基因片段 ,经酶切后插入EGF PET2 8A载体 ,并转化至BL2 1(DE3 )中。采用Westernblot对重组毒素进行鉴定。结果EGF PE3 5KDEL重组毒素占菌体总蛋白的 2 0 % ,分子量约为 410 0 0。结论　EGF PE3 5KDEL的成功构建和表达为开发靶向抗癌药物奠定了基础     

促黄体激素释放激素-TAT-p53融合蛋白制备及其对肿瘤细胞增殖作用的影响

目的制备促黄体激素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH)-TAT-p53融合蛋白,探讨其抗肿瘤作用。方法以重组质粒pET28a-p53为模板,经PCR扩增目的基因,双酶切,克隆至原核表达载体p ET20b中,构建重组表达质粒p ET20b-LHRH-TAT-p53,并在E. coli中IPTG诱导表达,经金属螯合层析、DEAE弱阴离子交换层析纯化目的蛋白。取对数生长期的HeLa、BGC及MDCK细胞进行细胞活性试验,检测pET28a-p53蛋白活性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET20b-LHRH-TAT-p53构建正确;融合蛋白相对分子质量约54 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白55%;HeLa及BGC细胞加入纯化复性的重组蛋白后,细胞变圆、色暗、折光性变差,甚至裂解死亡,细胞死亡数增加,而MDCK细胞无变化;一定浓度范围内(25～120μg/m L)蛋白对HeLa及BGC细胞有明显的抑制作用。结论成功制备了LHRH-TAT-p53融合蛋白,该蛋白具有生物活性,对肿瘤细胞有杀伤作用。本研究为下一步制备靶向LHRH的肿瘤治疗药物提供了参考。     

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65融合蛋白的表达及纯化

目的在大肠埃希菌中融合表达绿脓杆菌外毒素A(pseudomonas exotoxin A,PEA)受体结合亚基-结核分枝杆菌热休克蛋白65(heat shock protein 65,HSP65),并进行纯化。方法从含PEA的质粒中扩增PEA受体结合区亚基PEAⅠ,克隆至pET-28a-HSP65质粒中,构建重组表达质粒pET-28a-HSP65-PEAⅠ,转化大肠埃希菌(E.coil)BL21(DE3),IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE分析;利用抗PEA受体结合区单抗杂交瘤细胞制备抗PEA受体结合亚基单抗,偶联免疫亲和层析介质,将表达的重组蛋白经DEAE Sepharose 4FF阴离子交换层析、Phenyl Sepharose 6FF疏水层析和免疫亲和层析进行纯化。结果重组质粒经PCR鉴定及测序,证明构建正确;表达的重组HSP65-PEAⅠ蛋白相对分子质量约93 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上;抗PEA受体结合亚基单抗效价可达1∶10 000。纯化的重组HSP65-PEAⅠ蛋白纯度达90%以上。结论已成功在大肠埃希菌中表达并纯化了重组融合蛋白HSP65-PEAⅠ,为防止PA感染后多器官衰竭综合征的免疫制剂的研究奠定了基础。     

LHRH-PE40对荷瘤BALB/c小鼠抗肿瘤效果的实验研究

目的 观察LHRH-PE40对小鼠腹水瘤及实体瘤的治疗效果,为确定药理、毒理学实验剂量提供依据。方法 分别给BALB/c小鼠腹腔内和背部皮下接种骨髓瘤SP2/0细胞,接种后第4d和第9d,分别腹腔注射LHRH-PE40,并设空白对照组,停药后第5d处死,观察两组小鼠腹水和腹腔内肿瘤生长情况,称量瘤重,计算抑瘤率。结果 腹水瘤实验组所有小鼠腹部未见腹水,腹腔未见肿瘤。实体瘤实验组抑瘤率为54％。结论LHRH-PE40可以有效地抑制荷瘤小鼠实体瘤的生长。     

LHRH-PE40的免疫原性及其抗体对细胞毒作用的影响

目的观察连续静脉注射重组毒素LHRH-PE40所引起的家兔抗LHRH-PE40抗体产生的规律以及该抗体对细胞毒作用的影响。方法将家兔分为3组,第1组隔日连续静脉注射LHRHPE40,第2组用弗氏佐剂乳化的LHRHPE40皮下注射为阳性对照组,第3组静脉注射人血白蛋白为阴性对照组。用ELISA检测血清中的抗体水平,XTT检测LHRH-PE40与血清中和后对Hela细胞的细胞毒作用。结果抗LHRHPE40抗体水平随静脉注射时间的延长而升高,8d可以检测到抗LHRH-PE40抗体,在24d基本达到最高水平。血清中和后LHRHPE40对Hela细胞的半数抑制量较阴性血清提高1～2倍,而阳性血清较阴性血清提高14倍。结论连续静脉注射LHRH-PE40产生较低水平的抗体,这种抗体未造成LHRHPE40对Hela细胞半数抑制量产生严重影响,这为临床连续使用LHRH-PE40提供了依据。     

LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用

目的研究LHRH-PE40对LOVO细胞的靶向杀伤作用。方法用XTT检测LHRH-PE40对LOVO细胞的体外细胞毒性。将LOVO细胞移植于裸鼠,测定静脉注射LHRH-PE40对体内肿瘤细胞生长的抑制作用。结果LHRH-PE40对LOVO细胞细胞毒作用的半数抑制浓度为2·103μg/ml,在裸鼠肿瘤模型中,LHRH-PE40剂量为150μg/kg时抑瘤率为68·49%,这种细胞毒性作用可以被LHRH(或LHRH类似物)特异性抑制。结论在体内外LHRH-PE40对LOVO细胞具有很强的细胞毒作用,其机制是LHRH-PE40通过与癌细胞膜上的LHRH受体特异结合发挥细胞杀伤作用。     

人食管癌及宫颈癌组织中HSP70基因的表达

目的　了解HSP70基因在不同癌组织中的表达情况。方法　采用人的HSP70基因探针P1 7与从人食管癌及宫颈癌组织中提取的RNA进行Northernblot。结果　食管癌和宫颈癌组织中出现的杂交信号均比正常组织强。结论　HSP70基因在癌组织中有高表达。HSP70可能在癌变过程中起着重要的作用。     

Expression of CD40 and CD40L in Gastric Cancer Tissue and Its Clinical Significance

To study expression of CD40 and CD40L in gastric cancer tissue we assessed gastric cancer patients admitted to the Department of Gastroenterology of The First Affiliated Hospital of Soochow University and control subjects. Gastric cancer and normal (from around tumours) tissue samples were obtained from patients. Venous blood samples (gastric cancer and ulcer groups) were drawn on the morning of the day before surgery for the measurement of peripheral sCD40L. The expression of CD40 in gastric carcinoma specimens was examined immuno-histochemically. The clinicopathological factors, including age, sex, tumor size, gross appearance, degree of cellular differentiation, histological classification, depth of tumor invasion, lymph node metastasis, peritoneal dissemination, and TNM stage were analyzed according to the different expression of CD40. The results indicated a high CD40 expression in gastric cancer tissues. This positive expression of CD40 revealed a significant (P < 0.05) correlation with lymphatic metastasis and tumor TNM stage in gastric cancer patients. It is concluded that higher CD40 expression existed in expanding type tumors and could play an important role in clinical diagnosis of gastric cancer patients.     

Cervical Carcinoma: Oncobiology and Biomarkers

Cervical cancer is one of the most common types of carcinomas causing morbidity and mortality in women in all countries of the world. At the moment, the oncology, oncobiology, and oncomorphology of cervical cancer are characterized by the accumulation of new information; various molecular biological, genetic, and immunohistochemical methods of investigation of the mechanisms of cervical carcinogenesis are tested and applied; targeted antitumour drugs and diagnostic, prognostic, and predictive biomarkers are being searched for. Many issues of the etiopathogenesis of cervical cancer have not been sufficiently studied, and the role of many biomarkers characterizing various stages of cervical carcinogenesis remains unclear. Therefore, the target of this review is to systematize and understand several problems in the pathogenesis of cervical cancer and to evaluate the significance and role of biomarkers in cervical carcinogenesis.     

110例宫颈癌根治术的并发症分析

目的分析宫颈癌根治术并发症的发生及其相关因素,探讨其防治方法。方法110例宫颈癌行广泛性子宫切除术加盆腔淋巴结清扫术,其中ⅠA期10例,占9.09%;ⅠB期75例,占68.18%;ⅡA期23例,占20.91%;ⅡB期2例,占1.82%。鳞癌89例,占80.91%;腺癌和腺鳞癌19例,占17.27%;其他2例,占1.82%。结果发生手术并发症30例,发生率为27.27%。手术并发症主要为尿潴留、淋巴囊肿、腹部切口感染,发生率分别为17.27%、9.09%、5.45%。结论严格把握手术指征,术中仔细操作,减少副损伤,术后加强护理,及早发现并处理并发症的诱因,可以减少手术并发症的发生。