干酪乳杆菌胞壁蛋白酶提取条件优化及其水解特性研究

干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶是其蛋白水解系统中一个关键的蛋白酶.采用Ca2+-free法研究干酪乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取方法,确定其最佳实验条件.菌体用含有30 mmol/L CaCl2的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)缓冲液洗涤3次,然后用含有50.03 mmol/LEDTA-Na2的50 mmol/LTris-HCl(pH6.98)缓冲液悬浮,39.75℃保温,60 min后取出离心(4 500 r/min、20 min、4℃),上清液即粗酶液.用粗酶液与纯化后的酶分别水解各种酪蛋白,粗酶较纯化后的酶能产生更高的ACE抑制能力,而纯化后的酶水解β-酪蛋白产生的抗ACE活性能力最强.     

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取

确定提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的最佳方法和最佳提取条件。在单因素试验的基础上,采用多指标正交试验设计和综合平衡分析法研究溶菌酶结合非离子表面活性剂法提取发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的裂解液成分和提取条件。结果表明：裂解液的成分为50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl、体积分数3% 吐温-20、2mg/mL 溶菌酶、pH8.9;提取条件为裂解液与菌体的比例10:1(V/m)、保温时间5h、保温温度37℃时酶比活力达38.957U/mg,此时可最大效率的获得发酵乳杆菌的细胞壁蛋白酶。     

发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶的分离纯化及酶学性质研究

研究分离纯化发酵乳杆菌细胞壁蛋白酶(cell envelope proteinase,CEP)的方法及其酶学性质。用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)悬浮菌体,进行超声波破碎,细胞质量浓度为0.06g/mL,破碎功率330W,工作220次(工作时间3s,间隔时间5s),离心取上清液即为粗酶液。60%硫酸铵沉淀,Sephacryl S-300 HR凝胶层析,Native-PAGE割胶回收纯化发酵乳杆菌的CEP。用纯化的CEP 酶解脱脂乳,酶解液ACE(angiotensin I-converting enzyme)抑制率为50%。SDS-PAGE检测CEP分子质量为32.5kD,最适酶反应温度为41℃,最适酶反应pH值为8.0。Mg2+、Co2+、Ca2+对CEP活性有激活作用;Zn2+、Ni2+、PMSF、EDTA对CEP活性有抑制作用,说明CEP为丝氨酸蛋白酶且酶的活性中心结构的维持与金属离子有关。     

乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶的分离纯化

本研究确定了分离纯化乳酸乳球菌细胞壁蛋白酶(CEP)的最佳技术路线.用裂解液(50mmol/L Tris-HCI,2mmol/L EDTA-Na2,100mmol/L NaCl,0.5%Tritonx-100,1mg/ml溶菌酶,pH8.5)悬浮菌体(20ml/g),37℃下保温3h,离心后取上清液即为粗酶液.粗酶液通过45%硫酸铵沉淀,DEAE-Sephadcx A-25和Sephacryl-S-300 HR两步层析,可以得到纯化的细胞壁蛋白酶.蛋白酶提纯倍数达到74.048%,最后回收率为14.865%,PAGE电泳检测为一条带,SDS-PAGE检测蛋白酶为单体结构,分子量大约为53kD.用纯化后CEP酶解乳清蛋白,酶解液ACE抑制率为45%.     

嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶的提取优化

为了获得较高酶活力的嗜酸乳杆菌细胞壁蛋白酶(CEP),对嗜酸乳杆菌CEP的提取方法进行优化。经过比较超声波破碎法、Ca2+-free法、溶菌酶裂解3种方法,确认溶菌酶裂解法结合使用非离子清洁剂破壁是提取嗜酸乳杆菌CEP的最佳方法。在单因素试验的基础上,采用正交试验对嗜酸乳杆菌CEP的提取工艺进行优化,得出嗜酸乳杆菌CEP的最佳提取方法：用裂解液(50mmol/L Tris-HCl、100mmol/L NaCl、TritonX-100添加量1%、1.5mg/mL溶菌酶,pH 7.8)悬浮菌体(20mL/g),37℃保温3h,4℃、4500r/min离心20min,取上清液。溶菌酶裂解法提取CEP过程中各因素对CEP提取效果的影响依次为：溶菌酶质量浓度＞裂解pH值＞TirtonX-100添加量＞保温时间。     

生姜蛋白酶的分离纯化及其酶学性质初步研究

以新鲜生姜为原料,以生姜蛋白酶酶活为考察指标,对生姜蛋白酶的提取及纯化工艺进行研究。结果表明:以pH6.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液为提取溶剂所得酶活力较高,最佳工艺为:以pH6.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液25℃提取2次,料液比1∶1;应用硫酸铵盐析及透析袋透析对粗酶液进行纯化,粗酶液再以60%硫酸铵盐析24h,透析袋(14000)低温透析12h,冻干;酶学性质研究表明:生姜蛋白酶以酪蛋白为底物其最适pH值为6.0,30℃保温30min,酶活稳定。     

草鱼消化道粗蛋白酶的部分性质

用丙酮脱脂然后用磷酸盐缓冲溶液从草鱼肠道中提取一种主要含有酸性蛋白酶和碱性蛋白酶的粗蛋白酶。该粗酶水解血红蛋白的最适pH=3～4，水解酪蛋白的最适pH值有2个，分别为pH4．4和PH10．3。水解牛血红蛋白的最适作用温度为37℃，水解酪蛋白的最适作用温度为45℃。酸性蛋白酶在50℃保温30min后只有大约20％的最初活性被保留，而要使碱性蛋白酶丧失80％的最初活力需要在60℃保温30min。     

巴西松子中蛋白酶的分离纯化及酶学性质

在单因素试验基础上,通过正交试验研究pH值、提取时间和料液比3个因素对巴西松子中蛋白酶活力的影响,得出巴西松子中蛋白酶的最佳提取缓冲液为pH9.0的硼酸-硼砂缓冲液、提取时间为60min、料液比为1:8(m/V);采用(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose FF阴离子交换层析分离纯化巴西松子中的一种蛋白酶,结果表明:纯化后蛋白酶比活力提高到了8.61倍,回收率为21.65%。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明:该蛋白酶分子质量为33kD。酶学性质结果表明:该蛋白酶最适pH值为9.0,属碱性蛋白酶;反应的最适温度为50℃;金属离子Mn2+对该蛋白酶活性有强烈的激活作用,而Ca2+、Mg2+和Cu2+对酶活性有抑制作用。     

芽孢杆菌B15胞外蛋白酶和淀粉酶的酶学性质研究

为探索芽孢杆菌B15胞外蛋白酶和淀粉酶在饲用酶制剂方面的应用,试验对其产酶情况及胞外酶的酶学性质进行了研究。结果显示,该菌株产蛋白酶和淀粉酶的最高酶活性分别为(181.9±3.5)U/mL和(50.2±1.6)U/mL。蛋白酶和淀粉酶的最适作用温度范围分别为40℃～50℃和40℃～70℃,最适作用pH值为7和5～7。蛋白酶和淀粉酶经40℃～50℃热处理,以及在pH值为5～9的缓冲液中较稳定。蛋白酶被EDTA所抑制,属金属蛋白酶,金属离子(10mmol/L)Mg2+和K+对其有激活作用,Fe2+有抑制作用,而Fe2+对淀粉酶有一定的激活作用。     

吸附结合超滤技术制备高活性菠萝蛋白酶的工艺研究

以菠萝皮渣为原料,研究纳米TiO2吸附结合超滤、冷冻干燥技术制备菠萝蛋白酶粉的方法.结果表明:在温度15℃条件下,以粗酶液质量3.5%的纳米TiO2吸附30 min,酶吸附率迭99.1%;采用O.4 mol/L、pH 6.O的柠檬酸缓冲液洗脱.将洗脱液用截留分子质量50kD的超滤膜超滤,流出液用截留分子质量10kD的超滤膜超滤,浓缩液经冷冻干燥得到比活力为2.8×106U/g的菠萝蛋白酶粉.     

磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究

研究重组磷脂酰丝氨酸合成酶表达条件及其用于酶法合成磷脂酰丝氨酸的反应条件。结果表明,在50 mL培养基中,菌体浓度为OD600=0.6时,用0.5 mmol/L的IPTG,在温度为20℃,转速为120 r/min的条件下,诱导12 h后,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力可达1.33 U/mL,是优化前的1.66倍。酶法转化磷脂酰丝氨酸的最适温度为38℃,最适pH为8.0,最适离子是12 mmol/L Mn2+,最适表面活性剂是1.0%Trition X-100。在最适条件下,磷脂酰丝氨酸转化率可达33.15%。     

凡纳滨对虾肌肉中组织蛋白酶L提取工艺优化及分离纯化

优化凡纳滨对虾肌肉中组织蛋白酶L提取工艺,分离纯化组织蛋白酶L并验证其对肌原纤维蛋白的降解作用.以凡纳滨对虾肌肉为原料,采用单因素试验、Plackett-Burman试验和双因素等重复试验对肌肉中组织蛋白酶L的提取工艺进行了优化.采用Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵沉淀、Q-Seharose F.F阴离子交换层析、S...     

南美白对虾酚氧化酶的提取及生化特性

以南美白对虾为研究对象,分析以Tris-HCl为提取缓冲液,研究提取液浓度、提取液pH值、浸提时间对酚氧化酶活力的影响,以L9（33）正交试验方法优化酚氧化酶提取条件,然后对南美白对虾酚氧化酶生化特性进行研究。结果表明：提取液浓度为0.2 mol/L、提取液pH值为8.0、浸提时间为20 min条件下提取的酶具有最大的活力;以邻苯二酚为底物时,酚氧化酶最适pH值为8、最适温度为40℃,在该条件下酶促反应动力学符合米氏方程,米氏常数Km为0.717 mol/L,Vmax为0.130 A/min。     

金银花过氧化物酶的三相分离纯化及酶学性质

采用三相分离法提取纯化金银花中过氧化物酶,结果表明最优纯化条件为pH?5.60、硫酸铵质量浓度39.49?g/100?mL、提取液与叔丁醇体积比1∶1.38,在该条件下纯化倍数为5.849,回收率为87.64%。金银花过氧化物酶比活力为1 021.6 U/mg,色素清除率为92%;酶学性质研究表明:金银花过氧化物酶最适温度为30℃,热稳定范围为10~40℃;最适pH值为5,pH值稳定范围为4~7。在金银花过氧化物酶催化的双底物酶促反应中,当H_2O_2浓度一定时,酶对愈创木酚的Km值为8.12?mmol/L,vmax值为1.71?mmol/(min·L)。当愈创木酚浓度一定时,H_2O_2的Km值为0.822?mmol/L,vmax值为1.38?mmol/(min·L)。金银花过氧化物酶与底物的亲和力由强到弱依次是邻苯三酚、邻苯二酚、联甲氧基苯胺、愈创木酚。Ca~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)对金银花过氧化物酶有激活作用,Mg~(2+)、Mn~(2+)、柠檬酸、抗坏血酸、L-半胱氨酸、亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、十二烷基磺酸钠对金银花过氧化物酶有不同程度的抑制作用。     

利用层析法纯化鹿胎盘多肽的研究

利用离子交换柱及凝胶层析柱对鹿胎盘多肽进行纯化,试验结果表明,鹿胎盘多肽粗提溶液利用Q- Sepharose Fast Flow柱,用5 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液洗脱得到3个组分,经E-玫瑰花环试验证实,第2个组分生物活性较高,使脱受体的人体T淋巴细胞的E-玫瑰花环率恢复到62.5%。将分离出的较高活性组分经Sephadex G-50凝胶层析柱,用50 mmol/L的NaCl缓冲溶液洗脱,得到2个组分,第2个组分具有较高活性,使脱受体的人体T淋巴细胞的E-玫瑰花环率恢复到72.5%,其特征吸收峰在228 nm处。     

根霉胞内α-半乳糖苷酶的分离及其酶学性质

根霉Rhizopus sp.A01的菌丝体破碎液依次经过三相分离、Sephadex G-100凝胶过滤获得了电泳纯的α-半乳糖苷酶,纯化了54.8倍,总酶活回收率达到27.3%,在SDS-PAGE上显示相对分子质量为85.6 ku的单一条带,凝胶过滤表明该酶表观相对分子质量为302 ku。该酶水解对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷的最适pH值为4.5,最适温度为55℃,表观Km值为(0.242±0.027)mmol/L,表观kcat/Km值为4.089×105L/(mol.s);对蜜二糖和棉子糖有弱的水解作用,水解速度依次为138.3μmol/(h.mg)、19.7μmol/(h.mg)。水解活性受Fe2+和Fe3+的显著激活,但受Mn2+、Cu2+、Hg+和Mg2+等离子的强烈抑制。该酶活性在pH4.0～8.2保持稳定,在50℃时保温90 min,残余酶活达到了48%。     

方波脉冲电穿孔法提高酵母菌细胞通透性的条件优化

为了采用电穿孔法提高酵母菌细胞的通透性,将通过离心得到的酵母菌制成1 × 108CFU/mL 的菌悬液,采用不同的方波电脉冲条件对其进行处理。结果表明：在0.6mol/L 的蔗糖等渗电脉冲介质中,当酵母菌细胞的处理条件为电场强度7kV/cm,脉冲宽度50μs,脉冲数14,间隔时间2s 时,细胞的存活率平均为81.16%,电穿孔率平均为65.14%。这表明电穿孔法可以有效增强酵母菌细胞的通透性。     

产谷氨酸脱羧酶片球菌的鉴定及其酶学性质

从发酵蔬菜中分离一株产谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)的乳酸菌HS2,其菌体细胞转化Glu 1h,转化液中γ- 氨基丁酸含量可达(3.114 ± 0.133)g/L,通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育分析,鉴定菌株HS2 是戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。菌株HS2 GAD 最适作用温度为35℃,最适作用pH4.5。酶的热稳定较好,在pH4.0～6.5 于50℃处理4h,酶活基本稳定。Ca2+ 对酶有激活作用,5mmol/L 和50mmol/L Ca2+ 浓度使酶活分别提高了37.21% 和23.02%。Mg2+ 和Mn2+ 在50mmol/L 浓度时激活作用明显,而Co2+在5mmol/L 浓度激活作用较好。