幽门螺杆菌尿素酶B亚单位特异性抗体检测方法的建立与评价

目的建立并评价幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)特异性抗体的检测方法。方法应用纯化的重组HpUreB作为包被抗原,建立检测HpUreB特异性抗体的ELISA间接法。以Hp抗体Western blot检测作为“金标准”,评价所建立方法的真实性和可靠性。结果检测血清特异性IgG的灵敏度为100·0%,特异度为97·7%,阳性预测值为97·2%,阴性预测值为100·0%,约登指数为0·977,符合率为98·7%,试验的一致率为98·5%;检测血清中总的特异性Ig灵敏度为97·1%,特异度为95·3%,阳性预测值为94·4%,阴性预测值为97·6%,约登指数为0·925,符合率为96·2%,试验的一致率为97·8%;检测唾液中特异性sIgA的灵敏度为96·2%,特异度为94·5%,阳性预测值为89·3%,阴性预测值为98·1%,约登指数为0·907,符合率为95·1%,试验的一致率为97·5%;检测粪便标本中的特异性sIgA的灵敏度为92·0%,特异度为90·2%,阳性预测值为85·2%,阴性预测值为94·9%,约登指数为0·822,符合率为90·9%,试验的一致率为98·6%,CV值均小于15%。结论该检测方法真实性、可靠性、重复性良好,能满足临床标本检测的要求。     

幽门螺杆菌尿素酶表位疫苗的构建、表达及鉴定

目的构建和表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)尿素酶B亚单位(UreB)表位串联体(Uepi)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)融合蛋白表位疫苗,并对其生物学及免疫学特性进行鉴定。方法设计引物,采用PCR法分别扩增UreB表位多肽编码基因Uepi和LTB编码基因,重叠延伸PCR法将两段基因拼接,T-A克隆后,构建融合基因表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB,经酶切鉴定后转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果PCR扩增出206bp和336bp的目的片段,重叠延伸PCR扩增出524bp的融合目的基因片段。原核表达质粒pET-22b(+)-Uepi-LTB经酶切及测序鉴定,与设计序列一致。重组工程菌pET-22b(+)-Uepi-LTB/BL21经IPTG诱导,目的蛋白表达率约25%,SDS-PAGE分析相对分子质量约20000,目的蛋白以包涵体形式表达,纯化后蛋白纯度达96%,Westernblot鉴定该融合蛋白与兔抗LTB多抗血清可发生特异性结合。结论HpUreB表位串联体与LTB融合蛋白的表位疫苗经基因克隆,可获得高效表达,并显示出较好的免疫活性,为新一代Hp疫苗的研制奠定基础。     

从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位

目的 建立一种有效的方法，从包涵体中纯化重组人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位（rUreB）。方法重组大肠杆菌发酵后，表达的rUreB包涵体经洗涤、变性、复性，采用Q Sepharose Performance阴离子交换层析和Pheny1 Sepharose High Performance疏水层析分离纯化。使用 SDS－PAGE和HPLC检测纯度，选用 ELISA和 Western－bloning对纯化蛋白的生物学活性进行鉴定。结果 rUreB包涵体经洗涤和溶解后，rUreB的纯度＞70％。包涵体溶解液经阴离子交换层析和疏水层析后纯度超过95％。rUreB纯品具有良好的生物学活性。结论 建立了从包涵体中获得高纯度的rUreB的工艺，为进一步的研究打下了基础。     

幽门螺杆菌hp1188基因的克隆及高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)hp1188基因,为研究幽门螺杆菌的黏附机制奠定基础。方法用PCR法从H.pylori标准株NCTC11637基因组DNA中扩增hp1188基因,克隆入原核表达载体pQE-30,构建重组原核表达质粒pQE30-hp1188,转化大肠杆菌DH5α,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表达形式和表达量。表达蛋白经Ni2+-NTA树脂纯化,Western blot鉴定其反应原性。结果所构建的重组表达质粒pQE30-hp1188序列完整,插入的基因片段全长810bp,与GenBank中的hp1188基因同源性达98%。表达的重组蛋白相对分子质量约为30600,以1.0mmol/L IPTG诱导4h,表达量最高,破菌上清和沉淀中均有表达,可溶性蛋白表达量占全菌总蛋白的47%。重组蛋白纯化后纯度可达90%,并可被H.pylori患者血清识别。结论已成功克隆了H.pylori hp1188基因,并在大肠杆菌DH5α中获得高效表达。     

幽门螺杆菌尿素酶的纯化和鉴定

幽门螺杆菌超声波上清经DEAE SepheroseFastFlow和PhenylSepheroseCL 4B两步柱层析得到纯化的Hp尿素酶 ,免疫印迹显示有良好的抗原性。在pH8.0和 45℃条件下酶比活约为 2 6 5U mg ,SDS PAGE显示有 6 0 0 0 0和 30 0 0 0两个亚单位。经两步柱层析纯化后 ,Hp尿素酶回收率为 30 % ,纯化倍数达 11倍。连续纯化 3批显示工艺稳定 ,为Hp尿素酶基础研究和应用奠定基础。     

Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒菌重组疫苗的制备和生物效应研究

目的研制表达幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗,并观察其生物学效应。方法以幽门螺杆菌标准株——悉尼株(SS1)的基因组DNA为模板,构建Hp尿素酶B亚单位减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB。经口服免疫BALB/c小鼠后,检测肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体,同时观察小鼠体重、胃黏膜炎症程度等一般情况。结果构建Hp-UreB的SL3261/pTC01-UreB菌株,连续传80代可稳定表达Hp-UreB,菌落提取质粒后酶切及PCR鉴定均与pTC01-UreB符合;SDS-PAGE和Western blot显示pTC01-UreB转化SL3261可表达与Hp-UreB亚单位相符的相对分子质量约61000蛋白,该蛋白能与抗Hp兔血清反应;SL3261/pTC01-UreB口服免疫BALB/c小鼠的肠液中抗UreB的特异性IgA抗体和血清中IgG抗体明显增高,而小鼠体重和胃粘膜炎症指数与对照组差异无显著意义。结论Hp-UreB的减毒鼠伤寒杆菌重组疫苗SL3261/pTC01-UreB口服免疫小鼠可诱导特异性免疫应答。     

幽门螺杆菌粘附素hpa A和霍乱毒素B亚单位ctx B融合基因的原核表达

目的　构建幽门螺杆菌粘附素 (hpaA)和霍乱毒素B亚单位 (ctxB)融合基因的原核表达载体 ,诱导表达并进行纯化。方法　用PCR扩增hpaA和ctxB两个目的基因片段 ,克隆至同一pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pQE hct,转化E .coliDH5α ,经IPTG诱导表达融合蛋白HCT ;经Westernblot分析其免疫原性 ,采用镍离子柱进行纯化。结果　经测序HCT融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子质量约为 4 0 0 0 0。可溶性蛋白占菌体总蛋白的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组融合蛋白。经Westernblot检测可被Hp全菌抗血清和CT抗血清识别。结论　已成功构建融合蛋白HCT的原核表达载体并能高效表达 ,为研制Hp口服疫苗提供依据     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因(ureI)的克隆及其表达和纯化

目的　对幽门螺杆菌尿素通道蛋白基因ureI进行克隆、测序 ,并在昆虫细胞中表达及进行产物纯化。方法　克隆ureI基因 ,经测序正确后 ,酶切、连接到pFASTBACHb质粒上 ,与穿梭载体DH10BAC转座 ,获得Bacmid ureI质粒 ,转染Sf9细胞 ,采用Ni2 +螯合琼脂糖亲和层析纯化 ,经SDS PAGE和Westernblot鉴定。结果　克隆了ureI基因 ,并在昆虫细胞Sf9中表达纯化 ,蛋白纯度达 85 %以上 ,并与 6 His单抗特异结合。结论　表达及纯化的ureI蛋白为进一步研究打下了基础     

幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆、表达及鉴定

目的　克隆幽门螺杆菌粘附素基因hpaA ,构建其原核表达系统并鉴定融合蛋白免疫原性。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌总DNA中扩增hpaA基因 ,T -A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET30a的HpaA表达载体 ,在E .coliBL2 1DE3宿主菌中用IPTG诱导表达 ,Ni2 + 柱纯化后经Westernblot鉴定其免疫原性。结果　所克隆的hpaA基因与报道的相应核苷酸序列同源性为 94 . 8%～ 97. 3% ,氨基酸序列同源性为 94 . 6 %～ 97 .7% ,在 134～ 139位存在一段KRTIQK结构 ,HpaA融合蛋白在pET30a载体中可高效表达 ,经纯化后可获得高纯度的重组蛋白。结论　成功构建HpaA原核表达系统 ,所表达的融合蛋白具有较好的免疫原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原。     

幽门螺杆菌鞭毛蛋白B亚单位原核表达系统的构建及其产物的免疫性

目的　构建幽门螺杆菌 (Helicobacterpylori,Hp)鞭毛蛋白B亚单位 (flaB)原核表达系统 ,并鉴定其表达产物的免疫性。方法　采用PCR从幽门螺杆菌基因组DNA中扩增全长flaB基因 ,T A克隆后测定核苷酸序列 ,构建pET32a flaB表达载体 ,以E .coliBL2 1DE3为表达宿主菌 ,用SDS PAGE检测重组蛋白 (rFlaB)的表达水平。采用Hp全菌抗体的Westernblot和兔抗rFlaB血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和抗原性。结果　所克隆的flaB基因与文献报道的核苷酸序列同源性为 96 .31%～ 97.73% ,氨基酸序列同源性高达 99.4 1%～ 10 0 %。构建的原核表达系统pET32a flaB E .coliBL2 1DE3的rFlaB产量为细菌总蛋白的 4 0 %左右。Hp全菌抗体能识别rFlaB。rFlaB免疫家兔能获得高效价血清抗体。结论　已成功地构建了HpflaB高效原核表达系统 ,所表达的rFlaB有良好的免疫反应性和抗原性 ,可作为Hp疫苗的候选抗原     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB融合蛋白的表达及生物活性研究

目的 通过基因工程方法构建并表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(UreB)和大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)以基因形式的融合蛋白,并对其生物活性进行初步研究,为幽门螺杆菌疫苗的研究奠定基础。方法 用PCR方法从本室构建的融合基因克隆载体扩增出融合基因2 040bp的片段,将融合基因插入原核表达载体pET-11-c中。结果 经全自动测序仪测序,SDS-PAGE和免疫印迹以及N端氨基酸测序分析,证实融合蛋白已在BL21中表达,初步纯化后通过动物实验和酶联免疫吸附试验证实其相应的免疫原性和免疫反应性,以及其中LTB成分和GM1结合的特性。结论 融合蛋白表达方式为幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗的研究奠定了基础。     

幽门螺杆菌过氧化氢酶基因克隆及表达

目的 克隆幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)过氧化氢酶(katA)基因并在大肠杆菌中进行表达。方法 采用PCR扩增幽门螺杆菌katA全长基因,将其克隆入pET-11c载体中,经测序证实后,在大肠杆菌中进行表达,产物用Western blot检测其抗原性并进行N末端氨基酸的测序。结果 幽门螺杆菌katA基因全长1 518bp,编码氨基酸505个。在BL21(DE3)中的表达量约占细菌总蛋白的24.9％,表达产物经SDS-PAGE显示其相对分子质量与软件预测结果 58 000相符,N末端5个氨基酸测序结果与Hp中天然的katA完全一致,经Western blot检测可被 Hp全菌抗血清识别。结论 katA能在大肠杆菌中进行高效表达,具有良好的免疫反应性,可望为研究 Hp的致病机理、实验诊断及亚单位疫苗等提供充足的katA原材料。