副溶血性弧菌快速检测中实时荧光定量PCR技术的应用

目的 :分析实时荧光定量PCR技术在副溶血性弧菌快速检测中的应用价值。方法 :选取食品样本68份、食物中毒患者粪样20份,均行实时荧光定量PCR检测和常规培养,分析检测情况。结果 :细菌培养检出食品样本阳性20份,粪便样本阳性15份,实时荧光定量PCR对两种样本检出阳性数为22份、15份,两种方法对食品、粪便样本阳性检出率差异不显著(P0.05)。以细菌培养为金标准,实时荧光定量PCR对食品中副溶血性弧菌诊断的灵敏度、特异度、准确度为100%、96%、97%,对粪便样本副溶血性弧菌诊断的各参数均为100%。结论 :实时荧光定量PCR对副溶血性弧菌快速检测的应用价值高,诊断迅速且结果准确,值得推广。     

食品中副溶血性弧菌toxR和tdh基因双色荧光PCR检测方法的建立

目的 建立对副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）特异性检测toxR（跨膜转录激活蛋白）基因和tdh（热稳定性直接溶血素）毒力基因的Taqman探针双色荧光PCR检测方法。方法 根据副溶血性弧菌toxR基因和tdh基因,分别设计引物和探针,建立Taqman探针双色荧光PCR扩增体系,进行特异性、灵敏度试验;对副溶血性弧菌分离菌株实施检测,了解其tdh基因和tdh基因分布情况。结果 结果表明,副溶血性弧菌标准菌株和3株从食物中毒患者中分离获得的分离株均出现toxR基因和tdh扩增曲线,而溶藻弧菌、单增李斯特菌等31株弧菌属其他菌株和肠杆菌科的菌株未见扩增曲线。从食品中分离的37株副溶血性弧菌分离株均未携带tdh毒力基因。副溶血性弧菌检测灵敏度可达到3.6×102 cfu/mL。结论 该方法可用于同时检测食品中副溶血性弧菌的特异性和毒力基因。     

不同来源的副溶血性弧菌定性定量分析及毒素基因检测

目的研究受污染海产品、海产品养殖水及食物中毒临床分离的副溶血性弧菌的生化特性、种特异性基因片段检测方法的应用和毒素基因携带情况。方法66株副溶血性弧菌采用全自动微生物鉴定、MPN值定量、氯化物含量(离子色谱法)、R72H基因片段和tdh、trh毒素基因PCR检测等方法进行研究。结果定性定量分析方面,98.5%的菌株不发酵阿拉伯糖;牡蛎样本MPN值均为≥24000/100g,并检出2株携带trh毒素基因;23/30份养殖水检出副溶血性弧菌,其中海丰监测点6份阳性水样的氯化物含量均值仅为3160mg/L,显著低于实验室培养的30g/L的含量。基因检测方面,VITEK鉴定R72H基因片段结果与检测相符;13株食物中毒临床分离株均携带tdh毒素基因;6.7%的海产品分离株、15.4%食物中毒临床来源株同时携带两种毒素基因。结论通过从海产品和养殖水的检出情况以及分离株的生化特性、毒素基因资料,为副溶血性弧菌食物中毒溯源提供重要的数据源。     

上海市售海产品中副溶血性弧菌的分布状况

海产品中副溶血性弧菌引起的食物中毒已成为我国沿海地区细菌性食物中毒的首要病原。本研究中针对上海市闵行区某农贸市场的海产品开展为期1年的调查分析,共采集257份样品。按照国家标准(GB/T4789.7-2008),以硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(TCBS)和科玛嘉弧菌显色培养基(CV)两种选择性培养基辅助分离副溶血性弧菌疑似菌株,结合生化试验和PCR方法对疑似菌株进行鉴定,从84份阳性样本中获得107株副溶血性弧菌分离株。其结果表明:该农贸市场市售海产品中副溶血性弧菌的污染率为32.7%,其中牡蛎中副溶血性弧菌污染率最高(达54.4%),蛤蜊和海瓜子次之(分别为33.9%,25.6%)。牡蛎中副溶血性弧菌的污染水平与季节性变化直接相关。对107株分离株的主要毒力基因tdh和trh进行PCR筛查,tdh阳性菌株为10株,trh阳性菌株为1株,并且此株菌为tdh、trh双阳性菌株,tdh和trh的携带率分别为9.4%和1.0%,tdh、trh双基因的携带率为1.0%。结论:市售海产品中副溶血性弧菌污染状况较为严重。这为政府相关职能部门开展食品安全防控提供了参考依据。     

副溶血性弧菌ERIC-PCR分型及毒力基因检测研究

目的:建立副溶血性弧菌ERIC-PCR分子分型技术,分析副溶血性弧菌标准菌株及分离株基因组DNA ERIC-PCR指纹图谱,并对副溶血性弧菌毒力基因进行检测,以了解不同来源副溶血性弧菌毒力基因携带情况.方法:提取副溶血性弧菌基因组DNA,以肠杆菌基因间共有重复序列(ERIC)为引物进行PCR扩增,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像分析仪对图谱进行观察分析,并以相似性系数构建聚类图;通过PCR方法对直接耐热溶血素(TDH)和耐热直接相关溶血素(TRH)进行检测.结果:26株副溶血性弧菌均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,ERIC-PCR可将26株菌分为12个型,分辨力指数为0.926;只在临床分离株中检测到TDH基因,而除一株标准菌株外,所有菌株都未检测到TRH基因.结论:研究显示ERIC-PCR可从分子水平对副溶血性弧菌基因组DNA进行快速指纹图谱分析,同时结合毒力基因检测,能够为副溶血性弧菌食物中毒疾病的预防和流行病学调查提供科学依据.     

冰鲜金鲳鱼样品中一株副溶血性弧菌的分离与鉴定

目的对一株分离于冰鲜金鲳鱼样品中的菌株进行分析鉴定。方法利用TCBS培养基和弧菌选择性培养基从冰鲜金鲳鱼样品中分离到1株菌株sznj V083,并对该菌株的菌落形态、生理生化特征及其分子生物学特性进行分析。同时进行副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)标准菌株ATCC33847,创伤弧菌(Vibrio vulnificus)标准菌株ATCC27562的质控检验。结果该菌株在TCBS平板上呈现蓝绿色菌落,而在弧菌显色平板上呈现深蓝色菌落,其全自动生化鉴定结果显示其为创伤弧菌。PCR试验和16S rDNA序列分析表明,该菌株为副溶血性弧菌并与参考菌株Vibrio parahaemolyticus BB22OP(登陆号CP003973.1)的同源性最高。且该菌株的毒力基因tdh、trh检测为阴性。结论分离于冰鲜金鲳鱼样品中的菌株sznj V083为副溶血性弧菌。在副溶血性弧菌的检测中,除了常规的生理生化等方法外,还应该结合16S rDNA基因序列分析或PCR方法提高检测结果的特异性和灵敏度,以保证检测结果的真实性和准确性。     

辽宁省市售水产品中副溶血性弧菌的污染状况及耐药性分析

分析辽宁市售水产品副溶血性弧菌污染状况、毒力基因分布及耐药情况。方法 共采集420份水产品,应用国标方法和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对水产品中分离的副溶血性弧菌进行鉴定,并对分离菌株进行毒力基因及耐药性检测。结果 经国标方法和MALDI-TOF MS鉴定分离得到123株副溶血性弧菌,总检出率为29.29%(123/420)。不同种类、不同类别水产品副溶血性弧菌检出率差异均有统计学意义,海水产品检出率为33.44%,其中海水贝类检出率最高为49.51%;另外淡水产品中河蟹检出率较高为61.29%。分离的123株菌tlh基因全部阳性,未检测到tdh和trh基因,对氨苄西林耐药性显著,耐药率为94.31%。结论 辽宁省市售水产品不同程度受到副溶血性弧菌污染,尤其在河蟹中存在较高检出,应引起重视,并采取有效措施预防由水产品引起的副溶血性弧菌食源性疾病。同时,MALDI-TOF MS作为一种快速、准确、高通量的全新微生物鉴定技术,实现了对副溶血性弧菌的特异性快速鉴定。     

副溶血性弧菌与弧菌科易混淆菌的鉴别方法

目的 快速鉴别副溶血性弧菌检测工作中常见的几种易混淆菌。方法 首先筛选出7株在副溶血性弧菌检测工作中的易混淆菌株, 分别通过选择性平板、初步生化筛选和干制生化鉴定试剂盒的方法, 对包括副溶血性弧菌标准菌株在内的8株菌进行鉴别分析。结果 各菌株培养24 h后, 只有创伤弧菌能在改良纤维二糖多粘菌素B多粘菌素E琼脂平板上生长; 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基对弧菌科菌株鉴别性较强; 结合硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基以及弧显平板上的菌落大小和颜色特征, 可对以上8株菌进行鉴别, 利用各菌株在副溶血性弧菌的典型生化反应上的不同点, 可进一步进行验证。结论 掌握各检测阶段菌株的不同特征, 通过常规检测方法实现快速鉴别, 节省检测时间, 提高检测效率, 及时发现其它可疑致病菌。     

两起副溶血性弧菌食物中毒血清学溯源结果分析

目的 对两起副溶血性弧菌(VP)引起的食物中毒进行血清学溯源,分析可疑食品和病人样品中菌株血清型之间的关系.方法 依据GB/T4789.7-2008方法,对检出的VP做血清分型、溶血素试验;PCR扩增VP直接耐热溶血素基因(tdh)、tdh相关溶血素基因(trh)和毒素调控基因(toxR).结果 通过增加样品中可疑菌落数量的鉴定,两起食物中毒共检出9种VP血清型,主要有O3∶K6型13株,O2∶K28型6株,O1∶K56型2株,其它各1株;两起食物中毒中分离的27株VP有17株tdh基因检测阳性,与溶血试验结果一致.结论 增加可疑菌落数鉴定,有助于VP食物中毒的溯源;虽然O3∶ K6血清型是引起食物中毒的主要病原菌,但不同样品来源的VP血清型呈现多样性;副溶血性弧菌tdh基因检测等同于溶血试验来鉴定VP致病性.     

纳米免疫磁分离-实时荧光聚合酶链式反应快速检测海产品中副溶血性弧菌

采用副溶血性弧菌单克隆抗体、纳米免疫磁分离技术,结合实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测方法,建立海产品中副溶血性弧菌纳米免疫磁分离-实时荧光PCR检测方法。副溶血性弧菌纳米免疫磁珠在菌体浓度为103 CFU/mL水平时,对副溶血性弧菌的捕获率达到74%。在纯培养、无需增菌情况下,该方法检测灵敏度达到140 CFU/mL;通过134 株副溶血性弧菌和74 株非目标菌的测试,实时荧光PCR技术具有良好的特异性;在食品基质添加实验中,其检测限为2 CFU/25 g样品,增菌时间缩短到8 h。     

VITEK MS快速鉴定副溶血性弧菌的效果分析

目的评价VITEK MS对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的识别能力。方法培养平板选用弧菌显色平板和血平板,处理方法选用甲酸辅助裂解法(方法1)和直接涂板法(方法2)。每个菌株的不同培养平板与处理方法的组合分别用RUO软件和IVD软件进行鉴定,鉴定结果用配对卡方检验分析培养平板和处理方法对鉴定结果的影响。用RUO软件对图谱做相似性分析。结果 IVD软件可以对139株VP的不同培养平板和方法组合100%鉴定到种的水平,RUO软件对方法1和方法2处理的属水平鉴定率分别不超过60%和45%,种水平的鉴定率分别不超过17%和9%,2种处理方法结果差异具有统计学意义(P0.05)。同一种处理方法2种平板的结果差异无统计学意义(P0.05)。VP图谱之间的相似性为45%～90%,其和溶藻弧菌图谱之间的相似性为54%～78%。结论 IVD软件对VP有较好的鉴定效果,RUO软件对其鉴定效果不理想,甲酸辅助裂解法可以稍微提高鉴定率。VP图谱和溶藻弧菌图谱有交叉聚类的现象。     

实时荧光PCR方法检测副溶血性弧菌的研究

建立了一种快速检测副溶血性弧菌（vibrio parahaemolyticus,VP）的荧光PCR（Real time polymerase chain re-action）方法。首先,从GenBank中获得副溶血性弧菌种特异性基因不耐热溶血毒素基因tl和直接耐热溶血素毒素基因tdh,用Primer Express2.0设计引物和Taqman荧光探针,在Roche荧光PCR上进行荧光PCR扩增,荧光曲线表明该荧光PCR可特异性地检测副溶血性弧菌,而大肠杆菌等其他14种细菌和空白对照都是阴性;检测方法灵敏度达10cfu/reaction。本研究建立的荧光PCR检测副溶血性弧菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,可检测出总的和带tdh毒力基因的副溶血性弧菌,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。     

一起副溶血性弧菌食物中毒分离株的特征分析

目的 分析2017年广州市一起副溶血性弧菌食物中毒分离株的特征.方法 采用血清型鉴定,药敏实验,毒力基因(tdh、trh、tlh)、toxRS/new基因、orf8基因的聚合酶链式反应(PCR)检测,脉冲场凝胶电泳(PFGE)和多位点序列分型(MLST)进行分析.结果 14株副溶血性弧菌血清型鉴定为O8∶K21,药敏试...     

宁波地区食品中致病菌监测与流行株分析

目的了解宁波地区食品中致病菌检出情况和菌株的耐药性,发现其流行优势菌。方法致病菌检测采用直接分离与增菌分离相结合的方法;细菌鉴定采用生化筛检和API等方法;细菌分型采用诊断血清和PFGE基因分型;药敏试验采用K-B法,耐药基因检测采用PCR法。结果 6 812份食品样品中检出目标菌7类12种,共2 331份,检出率为34.22%,致病性弧菌检出数最高,其次为沙门菌和致病性气单胞菌。副溶血性弧菌与其他致病菌差异有统计学意义(P0.01),分离出10个血清群和29个PFGE型,其中O6、O5血清群和PFGE 1型是副溶血性弧菌的主要优势流行型。检出的致病菌对大多数抗生素敏感,其中3株气单胞菌为带aacc耐药基因的多重耐药菌。结论宁波地区食品中致病菌种类较多,易引起食源性疾病;各类致病菌均有流行优势株,副溶血性弧菌是最主要的流行优势株;血清分型和PFGE型能发现优势菌,但均有一定的局限性。     

副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS检测方法的建立与应用

目的:建立快速检测副溶血性弧菌基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测方法。方法:考察培养基、培养时间、培养温度以及样品前处理方法对图谱质量和鉴定结果的影响,对方法的稳定性、重复性进行研究;采集461株副溶血性弧菌食品分离株MALDI-TOF-MS指纹图谱,并对图谱进行分析。结果:采用2%NaCl-TSA培养基,在37℃,24 h条件下培养,可达到强峰值信号,谱图重现性良好,甲酸-乙腈提取法获得的质谱图特征峰多,信噪比高;461株副溶血性弧菌食品分离株有97.6%的菌株鉴定分值大于2.000。结论:本研究建立的副溶血性弧菌MALDI-TOF-MS鉴定方法结果准确,可用于实际检测。     

某海岛寺庙一起副溶血性弧菌食物中毒调查

目的对一起寺庙内发生的副溶血性弧菌食物中毒调查分析,为此类食物中毒的防制提供参考。方法对该起食物中毒进行流行病学调查、现场卫生学调查、实验室检测,通过病例对照研究和统计学处理,找出中毒原因并提出防制对策。结果本次中毒确认病例28名,其中僧人24名,从业人员和游客4名,中毒罹患率为5.6%(28/500);现场调查7月20日晚餐制作过程存在交叉污染情况,病例组与对照组就餐食物差异无统计学意义(P0.05);患者(含食堂从业人员)肛拭子标本和工用具样品检出副溶血性弧菌,血清型均为O3∶K6型,确定该起食物中毒为一起副溶血性弧菌食物中毒,中毒可能原因为食堂从业人员带菌且操作不当,污染7月20日晚餐而引起。结论本次事件提示寺庙食堂也会发生副溶血性弧菌食物中毒,相关部门应重视寺庙食物中毒风险,改善食堂卫生条件,落实食堂从业人员健康管理制度,加强监管监测和风险预警,以保障寺庙僧人和游客的食用安全。     

北京口岸进口鲜活海产品中副溶血性弧菌致病性分析

目的调查从北京口岸进口的鲜活海产品中是否存在致病性副溶血性弧菌。方法对2005年从北京口岸进口的鲜活海产品中分离的267株副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的尿素酶活性、神奈川现象和毒性基因（tdh和trh）进行了检测。结果267株副溶血性弧菌中27株尿素酶呈阳性，其中14株菌tdh基因和砌基因呈阳性。tdh基因和trh基因呈阳性的14株菌中有10株菌神奈川现象为阳性，并且全部分离自从加拿大进口的象拔蚌。结论北京口岸进口的鲜活海产品中存在致病性副溶血性弧菌，主要集中在象拔蚌中。应对从加拿大进口的象拔蚌加强监管，防止致病性副溶血性弧菌引起食物中毒发生。     

副溶血性弧菌快速定量检测方法研究进展

副溶血性弧菌（VP）是我国沿海地区食物中毒最常见的病原菌之一,引发的食品安全事件逐年上升。目前定量检测食品中副溶血性弧菌的国家标准方法为最大可能数法,该方法检测时限长且操作步骤繁琐,不能满足快速定量检测的需求。随着现代生物技术的发展,新的定量检测方法不断涌现,研发了多种快速灵敏的副溶血性弧菌定量检测方法。本文综述了近年来生物技术领域常见的定量方法在副溶血性弧菌快速定量检测中的研究现状及应用进展,充分了解各检测方法的特点,以期为食品中副溶血性弧菌的快速精准定量检测研究提供理论参考及发展方向。     

广州市2006－2009年水产品副溶血性弧菌监测结果分析

目的 了解广州市市售水产品副溶血性弧菌污染情况,为水产品安全性风险评估提供参考依据.方法 在全市12个区的餐饮企业、肉菜市场、超级市场、批发点等4类采样点,分季度抽取水产品样品进行副溶血性弧菌检测.结果 副溶血性弧菌检出率为13.55%(102/753).不同种类(x~2=13.106,P <0.05)、不同年份(x~2=55.583,P<0.05)、不同季度(X~2=15.612,P<0.05)以及不同采样地点(x~2= 14.268,P < 0.05)的水产品检出副溶血性弧菌情况不同.差异有统计学意义.结论 广州市市售水产品副溶血性弧菌检出率较高,为产生该类致病菌性食物中毒的安全隐患.     

一起由细菌混合感染引起的旅行团食物中毒案例分析

快速、准确地检测引起群体性食物中毒的有毒物质及其含量,为食物中毒应急处置提供科学依据。方法 根据食品安全事故流行病学调查技术指南及WS/T 82—1996、WS/T 81—1996诊断标准,采用常规方法及多重实时荧光PCR技术对送检的30份样品进行检测。结果 分别在送检的1份呕吐物中检出蜡样芽胞杆菌肠毒素,3份腹泻物中检出副溶血性弧菌,2份餐余食物中检出蜡样芽胞杆菌,1份餐余食物中检出副溶血性弧菌。结论 本次食源性疾病事件由蜡样芽胞杆菌及其肠毒素、副溶血性弧菌混合感染引起。