甘露聚糖酶Man1602中的色氨酸修饰及其突变体性质的研究

为了揭示色氨酸残基与Man1602酶活力的关系,提高Man1602的表达量,笔者通过研究色氨酸专一化学修饰剂与甘露聚糖酶Man1602的反应,同时根据甘露聚糖酶Man1602的序列比对结果,推测色氨酸残基与酶活的关系,对保守位点的色氨酸进行定点突变,检测各突变体酶的活力变化。结果表明,色氨酸为甘露聚糖酶Man1602的活性必需氨基酸,其中W196和W199位点的突变导致酶活几乎完全丧失,可以推断W196和W199为活性中心的氨基酸,W198也具有较高保守性,但对其突变并未造成酶的完全失活,推断W198是维持活性中心疏水性的重要氨基酸。     

融合β-甘露聚糖酶基因的构建、表达及酶学性质的分析

宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的糖苷水解酶5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)是一种仅含催化域(CM)的单结构蛋白。为改善其酶学性质,基于理性设计将海栖热胞菌(Thermotoga maritima)MSB8的27家族碳水化合物结合域(CBM27)融合至Au Man5A的C-端,并采用重叠PCR技术构建融合酶基因Auman5A-cbm27。分别将Auman5A-cbm27和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,对重组表达产物re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A进行纯化和酶学性质测定。结果表明,re Au Man5A-CBM27和re Au Man5A的最适温度均为68℃;两者分别在68和60℃及以下稳定。同时,前者较后者具有更广泛的p H稳定范围。re Au Man5ACBM27对角豆胶的Km值由融合前的1.7 mg/m L降至0.7 mg/m L,表明Au Man5A的底物亲和力得到了提高。     

枯草芽孢杆菌β-甘露聚糖酶的克隆表达及重组酶性质研究

为实现对魔芋葡甘聚糖具有高度专一性的β-甘露聚糖酶基因的异源表达,从枯草芽孢杆菌G1中克隆出β-甘露聚糖酶基因BsmanA,将该基因与表达载体pACYCDuet-1连接并转化到E.coil BL21(DE3)中。结果表明:该β-甘露聚糖酶基因BsmanA序列全长为1098 bp,编码366个氨基酸;经Ni柱亲和层析纯化后,测得重组酶分子量大小为38 kD;酶学性质研究结果显示:该酶促反应的最适温度为60℃,最适pH为6.5,在温度50~70℃间,pH4.5~7.0的范围内能保持较好的稳定性。本研究实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,为生物催化制备低聚甘露糖的工业化提供了新的选择。     

甘露聚糖酶RmMan134B与非均相湿热技术协同制备魔芋甘露寡糖

为挖掘新型GH134家族来源的甘露聚糖酶，评价其与非均相湿热技术协同制备魔芋甘露寡糖的应用潜力，从小孢根霉GZHF10的基因组中成功获得1个新型GH134家族甘露聚糖酶（Rm Man134B），该基因编码181个氨基酸和1个终止密码子，经分析，与已报道的GH134家族活性基因的序列一致性较低（<69.6%）。采用大肠杆菌PET表达系统对该基因进行异源表达及性质测定，结果表明，该酶最适底物为魔芋甘露聚糖，最适温度和pH值分别为40℃和5.0。将魔芋粉在115℃和0.1 MPa的条件下进行非均相湿热处理，魔芋聚糖的结构和性质发生显著改变，其中处理2 h魔芋粉的溶液的表观黏度（30 g/L）降低96.1%，粉末粒径变小，热稳定性提高，改性魔芋粉的水解率提高0.6～1倍。进一步研究发现，Rm Man134B酶解产物的主要成分为单糖（0.922 mg/L）、二糖（1.4 mg/L）和三糖（0.613 mg/L）。本研究对魔芋甘露聚糖资源的高效利用和产业化发展具有一定的推动作用。     

产气肠杆菌B19中β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质研究

将产气肠杆菌B19中的β-甘露聚糖酶基因(ManE)进行克隆,获得全长ManE基因序列,将ManE基因与pET28a(+)表达载体连接,转入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组菌株BL21(DE3)-pET-28a(+)-ManE,并成功表达了重组β-甘露聚糖酶。结果表明:克隆得到ManE基因序列全长为2196 bp,编码731个氨基酸。通过Ni柱亲和层析法分离纯化得到纯度较高的重组β-甘露聚糖酶,其分子量大小约为82.5 ku。重组β-甘露聚糖酶的酶学性质研究结果显示:最适反应温度和最适pH分别为55℃和6.5,在温度50~55℃,pH4.0~7.0的范围内都能保持较好的稳定性。1 mmol/L浓度的Co2+、Mn2+、Zn2+、Ba2+和Ca2+对重组β-甘露聚糖酶的酶活有不同程度的激活作用。而K+、Mg2+和Cu2+对该重组酶有不同程度的阻碍作用,其中Cu2+对该重组酶催化活性的抑制作用最强,酶活降低到最大酶活力的65.3%。本研究实现了β-甘露聚糖酶的异源表达,这些结果为该酶的进一步工业化应用提供了重要的理论依据。     

不同类型连接肽对β-甘露聚糖酶AuMan5A酶学性质的影响

以柔性肽F(GGGGS)3或刚性肽R(EAAAK)3为连接肽,将海栖热胞菌27家族碳水化合物结合域(CBM27)与宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶(Au Man5A)的C末端融合,探讨不同类型连接肽对Au Man5A酶学性质的影响,获取具有优良酶学性质的融合酶。采用重叠PCR技术扩增融合酶基因Auman5A-F-cbm~27和Auman5A-R-cbm~27,分别将Auman5A和融合酶基因在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物reAuMan5A、reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C的酶学性质。结果表明:该3种β-甘露聚糖酶对角豆胶的K_m值分别为1.7、1.9和0.9 mg/mL。3种酶的最适温度T_(opt)分别为70、65和70℃;reAuMan5A-F-C和reAuMan5A-R-C在70℃的半衰期t_(1/2)~(70)分别为36 min和124 min,较reAuMan5A的(t_(1/2)~(70)=9 min)延长了3倍和12.8倍。reAuMan5A-R-C具有底物亲和力强、热稳定性高和pH稳定范围广等特点,在食品、饲料、医药和能源等领域有着巨大的应用潜力。     

利用复合酶制备低聚甘露糖

为了探寻利用复合酶制备低聚甘露糖的最佳工艺,基于β-甘露聚糖酶和β-1,4-内切葡聚糖酶对魔芋精粉的水解具有协同作用的原理,以耐高温的重组β-甘露聚糖酶(re Au Man5AN3C3)为主,辅以不同活性单位的高催化活性的重组β-1,4-内切葡聚糖酶(re Au Cel12A)对魔芋精粉进行水解。通过研究不同酶的添加比例、酶解p H值、酶解时间、酶解温度和底物浓度等因素,获得复合酶最佳的复配比例及酶解工艺条件。同时研究了保护剂对复合酶稳定性的影响。研究结果表明:复合酶解魔芋精粉制备低聚甘露糖的最佳工艺条件为:用去离子水配制的30 g/L魔芋胶溶液,re Au Man5AN3C3和re Au Cel12A配比为1∶1.5(前者为60 U/g魔芋精粉),水解温度为60℃,水解时间为6 h,在此条件下魔芋精粉的水解率可达65%。薄层层析分析结果显示魔芋精粉经酶水解后产物主要是二糖以上的寡糖,且主要介于二糖与六糖之间,无单糖的产生。在有保护剂存在的情况下,复合酶在室温下存放2个月其残余酶活均能超过85%。     

生物合成甘露聚糖酶中氮源作用的研究

为了研究不同氮源及氨基酸对微生物合成碱性甘露聚糖酶的影响,分别进行了不同氮源对碱性β-甘露聚糖酶合成的影响、酵母氮基作为唯一氮源对碱性β-甘露聚糖酶合成的影响、在合成培养基中添加不同的氨基酸对微生物产酶的影响、几种氨基酸作为唯一氮源对微生物产酶的影响、在粗酶液中添加氨基酸对酶活的影响和几种氨基酸复配对碱性β-甘露聚糖酶...     

β-1,3- 葡聚糖酶基因克隆、表达及抗菌活性的研究

通过RT-PCR的方法分别从小麦和水稻的cDNA中克隆获得β-1,3-葡聚糖酶基因(Glu基因),分别命名为TaGlu9507和OsGlu30。它们的序列分析表明这两个克隆均含一个1002bp的开放阅读框(ORF),编码334个氨基酸,各自的N-端含有一个长20和29个氨基酸残基的信号肽序列。将不含信号肽序列的TaGlu9507和OsGlu30编码区DNA片段分别克隆进pET28-a(+)表达载体,并转入大肠杆菌BL21(DE3),经0.5mmol/L IPTG诱导3h后获得了高量表达,表达量分别占大肠杆菌可溶性蛋白的49.7%和26.7%,表达产物对黑曲霉、酵母等真菌生长均有较为明显的抑制作用。本结果更进一步表明β-1,3-葡聚糖酶基因是植物真菌病防治的潜在目的基因群之一。     

共表达伴侣蛋白对毕赤酵母产β-甘露聚糖酶发酵过程的影响

通过分别共表达伴侣蛋白PDI和Bip获得β-甘露聚糖酶在毕赤酵母中的高效表达。根据Gen Bank公布的毕赤酵母PDI和Bip序列设计引物,以酵母基因组为模板PCR扩增目的基因片段,插入表达载体p PICZαA,分别整合到β-甘露聚糖酶工程菌中,筛选共表达二硫键异构酶的重组酵母(PM115)和共表达免疫球重链结合蛋白的重组酵母(BM115),在30 L发酵罐水平上分析两种共表达伴侣蛋白菌株与初始菌株(GM115)对β-甘露聚糖酶表达的差异。相同工艺下,PM115与原始菌株相比未有提高,而BM115发酵产酶能力高于原始菌株,最高酶活达到40 900 U/m L,最高总蛋白表达量13.22 g/L,最高比酶活达到3 150 U/mg,分别比初始菌株提高38%,22%和18%。毕赤酵母基因工程菌GM115通过共表达伴侣蛋白Bip,提高了β-甘露聚糖酶的产量和比活力,达到工业化生产水平。     

牦牛乳硬质干酪苦味肽的分离与特征鉴定

为了探究牦牛乳硬质干酪中苦味肽组成特征,采用氯仿-甲醇法提取苦味肽,通过Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化,并利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry,LC-MS/MS）对其分离的苦味较强组分进行特征鉴定。结果表明：经Sephadex G-25葡聚糖凝胶色谱分离得到3 个不同分子质量的组分,组分Ⅱ具有明显苦味。LC-MS/MS鉴定出组分Ⅱ中存在14 种苦味肽,主要为氨基酸残基数目7～17 个、分子质量小于2 000 D的小肽,苦味肽序列中存在的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸,800～1 500 D苦味肽占64.29%,源自β-酪蛋白（β-casein,β-CN）降解产物的苦味肽占92.86%。因此,干酪成熟过程中源自β-CN的具有较强疏水性、分子质量小于2 000 D的混合多肽的积累可能对干酪苦味的产生有较大影响。     

β-1,3-1,4-葡聚糖酶研究进展

β-1,3-1,4-葡聚糖酶（EC 3.2.1.73）是一类内切型糖苷水解酶,广泛存在于各类微生物及植物中,对谷物β-1,3-1,4-葡聚糖的水解具有重要作用。在食品工业及饲料工业有着广阔的应用前景。目前已有GH16、GH17及GH26 3 个糖苷水解酶家族的β-1,3-1,4-葡聚糖酶结构得到解析。本文针对β-1,3-1,4-葡聚糖酶的来源、性质、结构、功能及应用的国内外研究现状进行综述。     

苦荞在萌发过程中营养物质的变化及其营养评价

通过测定萌发过程中苦荞的蛋白质、脂肪、脂肪酸、氨基酸、总糖、还原糖、α-、β-淀粉酶活性、矿物质元素、VB1和VB2的含量,研究萌发处理对苦荞营养价值的影响。结果表明：萌发过程中,蛋白质和脂肪等大分子物质均呈下降趋势;但可溶性低分子糖类、含氮物质和脂肪酸等小分子物质含量有较大提高,其中还原糖含量上升1.61%～10.63%,总氨基酸含量增加了3.85%,且7 种必需氨基酸含量均呈现上升趋势,赖氨酸增幅最大（30.5%）。与未萌发苦荞相比,VB1、VB2含量变化不大;同时,随着萌发过程的延长,α-、β-淀粉酶活性不断增强。萌发过程中,必需氨基酸/总氨基酸比值和必需氨基酸指数增加,必需氨基酸组成模式更加符合联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）联合食品标准计划,第一限制氨基酸由赖氨酸转变为蛋氨酸＋胱氨酸。     

BABA处理对葡萄果实采后灰霉病的影响及机理

以‘巨峰’葡萄果实为实验材料,研究β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid,BABA）处理对葡萄果实灰霉病、抗病相关酶活性和总酚含量的影响。葡萄果实先用75 mmol/L的BABA溶液处理后刺伤接种灰霉葡萄孢菌,然后转入25 ℃贮藏60 h。结果发现,BABA处理有效抑制了‘巨峰’葡萄果实的腐烂和病斑的扩展;同时BABA处理还诱导了果实中几丁质酶、β-1,3葡聚糖酶、苯丙氨酸解氨酶、4-香豆酸辅酶A连接酶和肉桂酸羟化酶等抗病相关酶活性以及总酚含量的提高。结果表明,BABA可诱导葡萄果实产生抗病性,从而减少灰霉病的发生。     

两株素食者肠道菌产β-葡萄糖苷酶考察及产酶条件优化

采用对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷法,与黑曲霉相比较考察素食者肠道菌LJ-G1、LJ-Q2产β-葡萄糖苷酶能力,再经单因素、响应面试验对菌种的产酶条件进行优化。结果表明:LJ-G1、LJ-Q2菌株均能产β-葡萄糖苷酶,且LJ-Q2产酶能力高于LJ-G1,与黑曲霉相比较,在发酵时间短于64 h时LJ-G1、LJ-Q2产酶能力高于黑曲霉;LJ-Q2菌种的最优产酶条件为:培养基p H 8.0、培养温度38℃、培养时间38 h。在最优条件下进行验证实验,酶活力达到1.70 IU/m L。加入大豆异黄酮原料进行发酵培养,得到游离大豆异黄酮转化率为39.4%。     

大麦在发芽过程中营养物质的变化及其营养评价

通过测定发芽大麦中的蛋白质、脂肪、淀粉、氨基酸、还原糖、β-葡聚糖、总膳食纤维、可溶性膳食纤维、不溶性膳食纤维、VB1和VB2的含量,研究发芽时间对大麦营养价值的影响。结果表明：发芽过程中,总干物质有一部分降解,蛋白质、淀粉和脂肪均呈下降趋势;但可溶性低分子糖类、含氮物质和维生素含量有很大提高,其中还原糖含量上升2.78%～14.36%,总氨基酸含量增加了8.15%,且7种必需氨基酸含量均逐渐增加,赖氨酸增幅最大（32%）。与未发芽大麦相比,VB2含量增长了17.8倍;VB1含量变化不大;β-葡聚糖呈下降趋势;可溶性膳食纤维增加。发芽过程中,必需氨基酸/总氨基酸值和必需氨基酸指数增加,必需氨基酸组成模式更加符合联合国粮食及农业组织/世界卫生组织联合食品标准计划,第一限制氨基酸由原来的赖氨酸转变为蛋氨酸+胱氨酸。结论：发芽在一定程度上提高了大麦的营养价值,但对其在利用β-葡聚糖相关功能特性方面有一定的限制。     

干扰LYC-B基因调控番茄果实挥发性物质及主要品质性状

构建含有番茄红素β-环化酶（lycopene β-cyclase,LYC-B）基因LYC-B中801 bp和301 bp两段保守序列的RNA干扰植物表达载体,农杆菌果实注射法遗传转化紫色番茄果实,通过卡那霉素抗性筛选、聚合酶链式反应及LYC-B基因表达量鉴定获得转基因植株,并对转基因植株成熟果实的挥发性物质及主要品质性状进行测定。结果表明,干扰LYC-B基因后番茄果实中检测到的挥发性物质主要为醇类、醛类、酮类、酯类和其他类。与野生型相比,转基因植株中总挥发性物质种类增加了6 种：醛类3 种、酮类2 种、酯类1 种;醇类个数不变;其他类减少1 种。醛类物质相对含量不变,醇类物质相对含量减少,酮类、酯类和其他类相对含量增加。特征挥发性物质反-2-庚烯醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮、水杨酸甲酯和2-异丁基噻唑等的相对含量增加。番茄红素的含量增加了16.78%,可溶性固形物、抗坏血酸和总酸等含量增加,β-胡萝卜素和总糖含量变化显著。干扰LYC-B基因不仅影响了番茄果实的挥发性物质,还增加了番茄红素、可溶性固形物、抗坏血酸、总酸等的含量。     

α-硫辛酸和乙酰左旋肉碱改善炎症细胞因子介导胰岛细胞功能障碍的作用

目的:探讨α-硫辛酸(α-lipoic acid,LA)和乙酰左旋肉碱(acetyl-L-carnitine,ALC)改善炎症细胞因子介导胰岛细胞功能障碍的效果并探讨机制。方法:大鼠胰岛素瘤RIN-m5f细胞用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和γ-干扰素(interferon-γ,IFN-γ)联合作用(TII)48 h造成损伤模型。LA和ALC干预48 h后噻唑蓝法检测胰岛细胞的活力情况,荧光细胞技术法检测细胞的形态学,流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)表达水平,放射免疫法检测胰岛素分泌情况,Western blotting检测细胞凋亡相关和胰岛素分泌相关蛋白表达情况。结果:TII作用48 h可使RIN-m5f细胞活力明显下降,凋亡增加;并降低基础状态下和高糖刺激状态下胰岛素分泌水平;增加ROS水平,增加一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)活性,增加一氧化氮(nitrogen monoxide,NO)水平,促进NF-κB向细胞核转位;TII还可增加RIN-m5f细胞内促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表达,抑制抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表达,增加线粒体细胞色素c释放。而LA、ALC可改善TII诱导的RIN-m5f细胞凋亡,提高基础状态和高糖刺激状态下胰岛素分泌水平;抑制NF-κB向细胞核转位、降低细胞NO水平;降低Bax、Caspase-3表达,增加抗凋亡蛋白I-κB、Bcl-2表达,抑制线粒体细胞色素c释放;LA与ALC联合作用效果强于单独作用。结论:炎症细胞因子作用48 h可通过ROS-cytochrome c-NF-κB-NOS-NO通路最终引起胰岛β细胞的凋亡,进而影响胰岛素分泌;LA和ALC联用可抑制炎症细胞因子诱导的胰岛细胞凋亡,促进胰岛素分泌。     

大米镉结合蛋白的分离及理化特性

本实验选用一种镉含量较高的大米为原料,采用碱法提取大米蛋白（alkali-extractable protein,AP）,依次用热变性和乙醇沉淀分离AP,制备大米镉结合蛋白（rice Cd-binding protein,RCBP）,并分析了RCBP的紫外吸收特征、氨基酸组成、分子质量及二级结构。结果显示：AP、热变性蛋白（thermally denaturated protein,TP）和乙醇沉淀蛋白（ethanol-precipitated protein,EP）均在210 nm波长处有最大吸收峰,氨基酸组成类似;热变性去除了分子质量为94 kD的蛋白质,分子质量为5 094 kD的蛋白质含量减少,乙醇沉淀进一步减少了分子质量分别为50 kD和14 kD的蛋白质。AP的二级结构主要为α-螺旋和β-转角,有少量β-折叠;TP的二级结构只含有β-折叠和β-转角,且以β-折叠为主;EP的二级结构主要为β-折叠和β-转角,还含有少量α-螺旋和无规卷曲。表明热变性和乙醇沉淀使得AP中的镉结合蛋白得到分离,可以作为一种分离RCBP的方法。