金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK原核表达、纯化及溶液构象分析

金黄色葡萄球菌K型肠毒素（Staphylococcus aureus enterotoxin K,SEK）由金黄色葡萄球菌肠毒素基因簇编码,流行病学显示,编码SEK蛋白的sek基因在食品源金黄色葡萄球菌菌株中具有较高的检出率,说明SEK也可能是一种重要的食品中毒潜在致病因子。本研究将截去N端信号肽的SEK蛋白编码基因与原核表达载体pET-28a（＋）连接,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-ΔNspsek;通过对sek基因在不同原核表达宿主菌中的表达及表达条件优化分析,确立SEK蛋白的最优表达条件;利用镍亲合层析纯化含组氨酸（His）标签的SEK融合蛋白,将凝血酶切除His标签后的SEK蛋白进行聚合状态及热稳定分析、荧光发射谱和圆二色谱分析。结果表明,重组蛋白SEK表达成功,热处理导致蛋白部分降解;荧光光谱揭示SEK蛋白在278?nm和295?nm波长处具有相同的最大色氨酸发射峰;344?nm波长处表明SEK蛋白处于紧密折叠的天然状态;圆二色谱分析表明,ΔNspSEK重组蛋白富含β-折叠（23.6%）、β-转角（28%）以及α-螺旋（29.1%）等二级结构。为深入研究SEK蛋白的结构与功能提供基础,也对改进食品加工工艺和提高食品安全具有指导意义。     

热诱导潜在食物中毒威胁源重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素去折叠及聚合过程

热失活工艺是降低加工食品中潜在的细菌和毒素含量的有效手段。M型金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins M,SEM）归属于V型超抗原,具有较弱的催吐活性,是一种潜在的金黄色葡萄球菌所致食物中毒威胁源。本研究利用圆二色光谱、荧光光谱、变性/活性聚丙烯酰胺凝胶电泳监测重组M型金黄色葡萄球菌肠毒素（recombinant staphylococcal enterotoxin M,rSEM）热诱导变性过程。结果表明,在低于40 ℃时,rSEM具有富含α-螺旋（17%）、β-折叠（32%）、转角（21%）的天然折叠态结构,分子表面唯一的121号色氨酸残基位于β-掌型结构域中相对疏水的环境中。随着温度从42 ℃升高到55 ℃,rSEM二级结构中减少的α-螺旋含量被增加的β-折叠/转角含量所弥补,蛋白质分子之间聚集状态未发生明显改变,最大荧光发射波长明显蓝移,同时350 nm和340 nm波长处的荧光强度比表现出反S型曲线,说明42～55 ℃温和加热可导致另一种形式的rSEM折叠中间态（intermediate state,IS）形成。在55～90 ℃温度范围内,rSEM二级结构基本维持稳定。与此同时,当加热温度从65 ℃升高至80 ℃时,350 nm与340 nm波长处的荧光发射强度比并未显示出蛋白处于完全变性状态,说明在加热过程中rSEM二级结构基本维持稳定,而三级结构具有较大动态变化的可能性,这可能与β-掌型结构域可以通过诱导契合结合具有不同构象的主要组织性相容复合体等位基因产物有关系。此外,在70 ℃乃至更高的温度,rSEM的聚集程度明显增加并且在90 ℃时达到最大。综上,rSEM中间态形成、聚合体产生以及稳定的β-折叠/转角结构是该蛋白在高温下依然保持热稳定性的基础。通过对rSEM热诱导去折叠过程的研究有助于阐明rSEM耐热机理,未来利用该方法对其他各类金葡菌肠毒素热失活机制进行类似研究将利于食品安全性生产工艺过程的改善。     

葡萄球菌A型肠毒素检测竞争ELISA方法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测食品中金黄色葡萄球菌A型肠毒素的方法,应用构建的pGEX-6P-SEA、pET28α-SEA重组质粒表达带有不同融合肽的葡萄球菌A型肠毒素,分别通过谷胱甘肽亲和纯化、镍螯合纯化获得SEA的重组融合表达蛋白HIS-SEA、GST-SEA,以HIS-SEA为包被抗原,以GST-SEA、天然SEA肠毒素为竞争抗原,确立了SEA型肠毒素ELISA检测的工作条件:包被浓度为2.5μg/mL,阳性血清稀释度为1:50,辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡免疫球蛋白工作浓度为1:2000.建立了以重组肠毒素GST-SEA作为竞争抗原检测葡萄球菌肠毒素SEA的间接竞争ELISA(ciELISA)方法,竞争肠毒素GST-SEA蛋白浓度x与P/N值y的关系式:x(GST-SEA)=1.99-y/0.34,R2(GST-SEA)=0.9964,线性检测范围均为1～62.5ng/mL,最低检测量为1ng/mL,此方法丰富了食品中A型肠毒素的检测手段.     

pfs基因原核表达载体的构建、表达及蛋白纯化

以植物乳杆菌KLDS1.0391的基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增得到pfs基因,与Gen Bank中的序列对比发现同源性为99%。将目的基因与表达载体p QE-30连接,并将重组质粒p QE-30-pfs转化到E.coli M15中。异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,经SDS-PAGE分析,在全菌体蛋白中含有一条明显的特异性蛋白条带,大小约为27.4ku。经Ni-NTA纯化系统纯化后,在SDS-PAGE凝胶电泳图上获得纯化产物的条带。结果表明,原核表达载体p QE-30-pfs构建成功,且Pfs蛋白在大肠杆菌中成功表达,采用Ni-NTA纯化系统成功纯化了重组蛋白Pfs,为体外合成AI-2(Autoinducer-2)奠定了基础。     

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因及其表达检测

金黄色葡萄球菌作为一种常见人类病原菌,可通过各种途径污染食品,引发食物中毒。其中,金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)的分泌会大大增加其侵袭性和致病力。通过对比肠毒素基因的携带及其表达情况,有助于进一步分析肠毒素表达的环境条件,为产肠毒素金黄色葡萄球菌的防范和控制提供理论和数据支持。本研究采用PCR和3M^TMTecra^TM微孔板法分别检测33株食源性金黄色葡萄球菌中5种传统肠毒素SEA^SEE基因的携带及表达情况,结果显示,该批金黄色葡萄球菌中SE基因的检出率为100%,携带率最高和最低的分别为seb(48.48%,16/33)和see(9.09%,3/33)。而其中SE蛋白得到表达的菌株仅为63.64%(21/33),这表明不是有SE基因携带就一定可以有相应毒素蛋白的表达,可能还需相应的系统调控和适宜的环境因素。     

食品基质中不同金黄色葡萄球菌肠毒素基因型表达差异研究

目的 比较研究食品基质中不同金黄色葡萄球菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins ,SEs)基因型的蛋白表达差异,为预防金黄色葡萄球菌食物中毒提供参考依据。方法 采用特异聚合酶链反应方法(polymerase chain reaction,PCR)对食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株进行肠毒素基因型检测;选择sea、seb、sec、sed等基因型阳性菌株,分别接种于胰酪大豆胨液体培养基(trypticase soy broth,TSB)、牛奶、鸡肉中,按照国家标准GB 4789.10—2016酶联免疫吸附试验法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)定量检测TSB培养基、牛奶和鲜鸡肉中不同金黄色葡萄球菌肠毒素基因型的蛋白表达量。结果 30株金黄色葡萄球菌中检测到14株肠毒素基因型阳性菌株,所占比例为46.67%,其中sea基因携带率最高(16.67%),而seb、sec、sed、seh则各占6.67%。SEA 在TSB、牛奶、鸡肉3种基质中的平均表达量为7.37 ng/mL,高于SEB、SEC、SED;不同基质环境对肠毒素的表达具有一定影响,如SEA、SEB、SEC、SED在TSB中的表达水平最高,平均表达量为9.04 ng/mL,牛奶次之,鸡肉最低。结论 肠毒素基因型的表达与菌株自身的调控及环境作用密切相关,本研究对肠毒素的产生机制进行初步了解,有助于进一步降低食物中毒风险。     

野生型金黄色葡萄球菌肠毒素A基因的克隆与分析

根据A、B、C和D肠毒素基因的序列设计特异引物,采用聚合酶链式反应(PCR)方法对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测和鉴定肠毒素基因型,并进一步克隆肠毒素基因。结果表明,待检食品中的金黄色葡萄球菌的肠毒素基因为A型,序列长为774bp,编码257个氨基酸残基,同其他肠毒素A高度相似,等电点为8.85,是一种膜结合蛋白,功能结构域和三位结构预测分析发现此蛋白含有肠毒素家族结构域和肠毒素C家族结构域。     

噬菌体编码的金黄色葡萄球菌肠毒素A的 研究进展

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种人畜共患的食源性致病菌,并且能够产生不同种类的毒素,其中金黄色葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin,SE)是引起食物中毒的一类主要毒素。金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A,SEA)在食物中毒事件中的检出率最高,毒性最强,成为目前研究的热点。编码金黄色葡萄球菌肠毒素A的基因sea是由噬菌体携带并在菌体之间传播的。本研究主要综述了编码SEA的噬菌体与SEA之间的关系、SEA的分类、在不同的食品基质中环境因子对SEA产生量、sea基因相对表达量的影响及SEA新型的检测方法等,并介绍了目前金黄色葡萄球菌肠毒素研究的难点及研究方向的分析。     

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因型检测与 分布研究

目的对食源性致病金黄色葡萄球菌肠毒素SEA~SEJ基因型分布状况进行调查,并探讨菌株分型与肠毒素基因型分布之间的关联性。方法采用PCR方法扩增金黄色葡萄球菌及肠毒素SEA~SEJ基因型核酸片段,应用全自动微生物基因指纹鉴定系统(Ribo Printer)对菌株进行分型和类聚状况分析。结果分离的24个待测菌株可分为6个亚型,各亚型均匀分布;待测10种肠毒素基因型中,SEI型、SEG型、SEA型和SEB型的出现频率较高,分别占54.2%、41.7%、37.5%和25.0%,同时表达两种以上肠毒素基因型的比率约50%,SEG型和SEI型肠毒素的表达分布具有协同性;金黄色葡萄球菌的溯源性特点与肠毒素分布规律一致。结论食源性金黄色葡萄球菌肠毒素呈现多基因型协同表达的特点,各菌株亚型与肠毒素基因型分布之间存在一定的关联性。     

建立金黄色葡萄球菌肠毒素B悬浮芯片定量检测方法

目的建立金黄色葡萄球菌肠毒素B悬浮芯片定量检测方法。方法利用双抗体夹心法免疫学原理,以金黄色葡萄球菌肠毒素B的特异性抗体包覆微球为载体,利用悬浮芯片(Bio-Plex)系统建立检测模型;检测不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B,测定方法的灵敏性;通过该方法对大肠杆菌、普通变型杆菌、蓖麻毒素和禽流感病毒HA、NH蛋白和金黄色葡萄球菌热休克毒素的检测,判断方法的特异性;将不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B添加到奶粉中验证方法的实用性和稳定性。结果悬浮芯片方法对金黄色葡萄球菌肠毒素B的检测线性范围为0.2～1653.4ng/ml,最低检测值为203pg/ml,均优于酶联免疫吸附实验;除与2.3μg/ml金黄色葡萄球菌热休克毒素有交叉反应外,和其他几种细菌、毒素、蛋白均无交叉反应;对添加相同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素B奶粉的检测的相对标准偏差在1.30%～16.93%。结论悬浮芯片定量检测方法对于模拟添加的金黄色葡萄球菌肠毒素B具有良好的检测效果。     

密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶基因xylA的克隆及其表达条件的优化

为克隆、表达密苏里游动放线菌葡萄糖异构酶(GI)基因xylA,并对其诱导表达条件进行初步优化。采用Slowdown PCR方法克隆得到密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)CICIM B0118(A)的葡萄糖异构酶基因xylA,构建pET-28a(+)-xylA 表达载体,并转化至E. coli BL21 (DE3),经异丙基-β -D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE 电泳。结果表明,融合蛋白分子质量约为45kD。在诱导时间9h、0.6mmol/L IPTG、30℃和OD600nm 值为0.8 的最适培养条件下,酶比活力最高达到62.42U/mL。     

草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位预测、克隆、表达及其免疫原性分析

应用IEDB、DNAStar、DNAMAN和Snap Gene等生物信息学工具对草莓轻型黄边病毒外壳蛋白的氨基酸残基序列进行分析。选择一段抗原性较强的肽段(位于外壳蛋白27~38氨基酸残基处),依据大肠杆菌(Escherichia coli)的密码子偏好性化学合成了该肽段的DNA编码序列(AE)。AE片段克隆至E.coli表达载体pET32a(+)的Eco RⅠ和XhoⅠ位点,获得重组质粒pET32a(+)-AE。含AE片段的开放阅读框长561 bp,编码了一个187氨基酸残基的重组融合蛋白,理论分子质量为20.29kD。重组质粒pET32a(+)-AE分别在E.coli BL21(DE3)和E.coli Rosetta中进行了诱导表达和条件优化。重组融合蛋白在E.coli Rosetta中的最佳表达条件为1.5 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、35℃诱导表达2 h,产率为13.22 mg/L;在E.coli BL21(DE3)中的最佳表达条件是为0.5 mmol/L IPTG、30℃诱导表达2 h,产率为9.55 mg/L。重组融合蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、质谱鉴定表明,其含有所预测的草莓轻型黄边病毒外壳蛋白抗原表位肽段AE。AE重组融合蛋白经Ni~(2+)亲和色谱纯化、EK酶切、分子筛除去融合蛋白标签后,免疫产蛋鸡。从免疫鸡所产鸡蛋中提取鸡卵黄免疫球蛋白(immunoglobulin of yolk,Ig Y),Dot-Blot检测抗体结合活性。结果表明,所提取的IgY可特异性识别AE肽段和SMYEV外壳蛋白。这一结果表明所预测的AE肽段具有较好的免疫原性。     

芹菜过敏原蛋白Api g1.02的克隆、表达及单抗制备

提取芹菜总RNA,反转录PCR(RT-PCR)扩增出过敏原蛋白Apig1.02基因,经PCR、酶切和序列测定后,得到重组质粒pET-32a-Apig1.02。将重组质粒转化到BL21(DE3)pLys感受态细胞中,用1mmol/L异丙基硫代-B-D-半乳糖苷(IPTG)对转化菌进行诱导表达及SDS-PAGE分析后,将表达蛋白提取纯化,制备单克隆抗体并进行Western blot分析。结果表明芹菜过敏原蛋白Apig1.02在体外获得了高效表达,表达融合蛋白分子质量约35ku,诱导6h后表达量最高,占菌体总蛋白的40%左右;制备的单克隆抗体能与表达蛋白发生免疫印迹反应,说明所表达的蛋白具有良好的免疫原性。该研究结果为建立芹菜过敏原蛋白的免疫学检测方法奠定了基础。     

变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶基因的原核表达

采用降落聚合酶链式反应（touchdown polymerase chain reaction,TD-PCR）技术,从2-酮基葡萄糖酸工业生产菌株变形假单胞菌JUIM01中克隆了编码2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的基因kguE。将目的基因与质粒pET-28a（＋）重组后转入宿主表达菌中,获得了重组菌株大肠杆菌BL21（DE3）/pET-28a（＋）-kguE。在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的诱导下,该重组菌株表达了一个分子质量约为30.5?ku的融合蛋白,且该蛋白的Western-blot鉴定结果显示为阳性。生物信息学分析结果表明,该蛋白是一种由256?个氨基酸残基组成的分子质量为28.5?ku的亲水性蛋白,与恶臭假单胞菌的2-酮基葡萄糖酸差向异构酶在氨基酸序列上的一致性达78%,定位于细胞质中,其二级结构中α-螺旋、延伸链和无规则卷曲所占的比例分别为40.62%、17.19%和42.19%。本研究结果为变形假单胞菌2-酮基葡萄糖酸差向异构酶的功能研究提供了一定理论支持。     

金黄色葡萄球菌噬菌体qdsa001内溶素的特性预测及克隆表达

为获得噬菌体qdsa001的内溶素,本实验首先利用多种在线软件对内溶素lys56（GenBank：ARQ95812.1）的理化性质、信号肽、跨膜域和结构域等特性进行分析,然后选择克隆表达法制备目的蛋白。将合成的目的基因插入原核表达载体pET-30a中,构建重组质粒pET-30a-lys56,转化至大肠杆菌Rosetta（DE3）中,获得表达稳定的基因工程菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导表达,利用镍琼脂糖亲和层析纯化表达产物。经在线软件预测结果显示,该蛋白分子质量为35.1 kDa,无信号肽和跨膜域,仅含有一个Ami_2结构域。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析显示重组蛋白表达成功,且以可溶性蛋白的形式存在于细胞破碎上清液,分子质量约35?kDa,与预期蛋白大小一致。重组蛋白最佳表达条件为：IPTG浓度0.5?mmol/L,20?℃过夜诱导。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性。方法PCR扩增出apoptin序列,与表达载体EC-SOD3-pET-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MTT活性检测。结果表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E.coliBL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性。结论成功构建了表达载体pET-28a-EC-SOD3-apoptin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力。     

一种新型凋亡素融合蛋白的克隆表达及活性测定

目的 克隆表达EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,并检测其生物活性.方法 PCR扩增出apopfin序列,与表达载体EC-SOD3-Pet-28a连接后在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导,表达产物进行Ni2+-NTA纯化和MIT活性检测.结果 表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apoptin经酶切鉴定和序列分析,证明质粒构建正确,转化E. Coli BL21(DE3)后,重组蛋白获得表达,Ni2+-NTA纯化后的凋亡素融合蛋白纯度达到85%以上,经噻唑蓝(MTT)法测定具有活性.结论 成功构建了表达载体Pet-28a-EC-SOD3-apopfin,并在大肠杆菌中表达了EC-SOD3-凋亡素融合蛋白,纯化的蛋白质具有诱导HeLa细胞凋亡的能力.     

不同质粒表达大肠杆菌碱性磷酸酶的研究

目的比较以pET-30a和pET-22b两个质粒表达碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)的活性差异。方法以质粒pET-30a-AP为模板,克隆大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)ATCC 25922的碱性磷酸酶成熟肽基因,并构建重组表达质粒pET-22b-AP。将这2种表达质粒转化到E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达AP。对温度和甲醇对AP活性的影响进行研究。结果 pET-30a-AP所产AP浓度约为pET-22b-AP 10倍时,才可达到类似催化效果;表达自pET-22b-AP质粒的AP对甲醇的耐受性略好于pET-30a-AP。结论本研究可为AP的生产及基因工程抗体-AP融合蛋白在类似ELISA等免疫检测方法的应用提供重要的参考依据。     

噬菌体基因Ⅴ蛋白基因的合成、重组表达及功能分析

目的:研究丝状噬菌体基因V蛋白(gene V protein,GVP)基因的合成、重组表达及其功能。方法:根据GVP的基因序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子,设计合成了8个寡核苷酸片段,利用重叠延伸PCR合成GVP基因序列,将其与原核表达载体pET-28a-c(+)质粒重组,转化大肠杆菌,获得GVP蛋白阳性表达菌株,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达,产物经Ni+-NTA琼脂糖凝胶层析纯化,获得目的蛋白GVP,DNA结合实验检测其功能。结果:成功合成出GVP基因,重组体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导获得高效表达,DNA结合实验表明GVP与单链DNA间解离平衡常数Kd=7.27×10-5mol/L。结论:重组构建并高效表达的GVP蛋白具有较高单链DNA结合能力,可用于食品病原微生物特定单链DNA分子的浓缩和分离。