黑曲霉丝氨酸羧肽酶的重组表达及其水解大豆蛋白的效果分析

丝氨酸羧肽酶能够剪切肽链C末端的氨基酸,在大豆蛋白脱苦中有着广泛的应用。该研究将黑曲霉中3个丝氨酸羧肽酶基因(CPG、CPF、CPA)在低背景的无孢黑曲霉HL-1中进行重组表达。利用启动子PnaⅡ、终止子Ttef和营养缺陷型筛选标记pyr G构建分别含自身信号肽和糖化酶信号肽的丝氨酸羧肽酶表达载体;利用PEG介导的转化法转化无孢黑曲霉宿主HL-1,构建了丝氨酸羧肽酶重组表达菌株。通过摇瓶发酵筛选得到高表达重组菌株HL-CPG,其丝氨酸羧肽酶酶活达到163.71 U/mL。利用6ⅹHis标签进行镍柱亲和层析得到单一的丝氨酸羧肽酶CPG并研究了其酶学性质,该酶最适反应温度为40℃,最适p H为3.5,Cu²⁺具有明显抑制效果。另外,将重组表达的丝氨酸羧肽酶CPG与胃蛋白酶复配水解大豆蛋白,水解液中疏水性氨基酸Leu、Tyr和Phe的含量分别增加606.47μg/m L、434.06μg/m L和205.11μg/m L。综上所述,该研究在黑曲霉中成功实现丝氨酸羧肽酶的高效表达,对大豆蛋白水解液脱苦处理工艺具有一定的借鉴意义。     

降解赭曲霉毒素A菌株的筛选及其鉴定

为了提供筛选生物降解赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）的便利条件,优化水系中OTA的测定方法。通过在水系中添加甲醇或乙醇的方法,使得水系中OTA回收率超过了90%,此外通过对比,当甲醇或乙醇与样液体积比为1∶1时,足以准确测定水系中OTA含量。利用以上方法对降解OTA的菌株进行筛选,发现细菌B-1和酵母Y-2均能够降解OTA,且细菌B-1在2 d时能降解87%的OTA,3 d将OTA全部降解,而酵母Y-2在2 d时就能够降解84%的OTA,在后续的培养中维持降解率不变。此外,利用液质联用法进一步确定了菌株B-1和Y-2的降解作用,并分析了降解产物。最后,通过分别分析细菌B-1和酵母Y-2的16S rDNA和ITS rDNA序列,菌株B-1鉴定为泡囊短波单胞菌,菌株Y-2鉴定为耶罗维亚酵母。     

赭曲霉毒素A降解酶Af-OTd的酶学性质分析

赭曲霉毒素A(OTA)是一种广泛分布在食品中的真菌毒素,减少或脱除食品及其原料中的赭曲霉毒素A,对提高食品质量、保障国民食品安全具有重要意义.本实验室前期从粪产碱菌中获得可降解OTA的酰胺水解酶Af-OTd,本研究通过基因重组实现Af-OTd蛋白的高效表达,并对纯化的Af-OTd蛋白进行酶学性质分析.结果表明:纯化的A...     

黑曲霉羧肽酶CapA的克隆表达与酶学性质解析

通过对A.niger CBS 513.88基因组信息进行阅读和比对分析,发现一个新的丝氨酸羧肽酶基因CapA,并在毕赤酵母中进行克隆表达.在摇瓶发酵水平,重组菌GS115(pPIC9K-CapA)的羧肽酶酶活达到109.7 U/mL.酶学性质研究表明该酶最适温度和pH值分别为45℃和6.0;在30℃～50℃或pH 4....     

veA基因影响黑曲霉生长及赭曲霉毒素合成

为探究全局调控因子veA基因对黑曲霉生长发育及赭曲霉毒素合成的影响,采用农杆菌介导的同源重组方法,构建过表达veA基因的黑曲霉菌株,比较出发菌株（黑曲霉CICC 41702）与veA过表达菌株（OE：：veA）在形态发展和赭曲霉毒素合成方面的差异。结果表明：OE：：veA菌株中veA基因的表达量与出发菌株相比提高了299%。相比于出发菌株,OE：：veA突变株的生长速度与出发菌株基本一致,但菌丝枝节较少且枝节较短,菌丝整体疏散,有更多的分生孢子头;赭曲霉毒素 β（ochratoxin β,OTβ）、赭曲霉毒素 α（ochratoxin α,OTα）、赭曲霉毒素 B（ochratoxin B,OTB）以及赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）含量都有大幅度降低。在培养的5、6 d和7 d中,出发菌株的OTA含量呈上升趋势,OE：：veA突变株基本保持不变,与出发菌株相比,OE：：veA菌株OTA的含量相对减少46%、63.33%、和75.81%。     

一种降解赭曲霉毒素A的羧肽酶酶原在毕赤酵母中的表达

目的:获得能降解赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)的重组蛋白羧肽酶A(r CPA)。方法:按照巴斯德毕赤酵母密码子偏爱性合成羧肽酶A酶原(Pro CPA)基因,构建重组质粒p PIC9K/Pro CPA,线性化后电转导入毕赤酵母GS115中,抗生素G418筛选获得高拷贝转化子。甲醇诱导表达5 d,上清用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析,基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。重组羧肽酶A酶原(r Pro CPA)用TPCK处理的胰蛋白酶酶解,酶解产物r CPA降解OTA,高效液相色谱(HPLC)测定降解率。结果:成功构建毕赤酵母重组菌株GS115/p PIC9K/Pro CPA。SDS-PAGE表明r Pro CPA分子质量与理论值一致,MALDI-TOF证实为牛胰脏Pro CPA,甲醇诱导表达5 d后上清的总蛋白含量190 mg/L。Band Scan软件估计r Pro CPA占上清的80%,含量为150 mg/L。酶解产物r CPA能降解OTA,当OTA质量浓度为4μg/m L时,降解率为72.3%。HPLC显示有降解产物OTα产生。     

赭曲霉毒素A单克隆抗体的体外制备及其重组抗体的构建研究

目的 实现抗赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)单克隆抗体的体外制备及其重组抗体表达载体的构建与瞬时转染表达。方法 以前期获得的OTA杂交瘤细胞株(O16)为研究对象,通过无血清驯化培养的方式开展OTA单克隆抗体的体外制备研究;采用简并引物法获取OTA杂交瘤细胞的单克隆抗体编码基因,在此基础上构建OTA重组全长抗体表达载体以及OTA重、轻链可变区基因片段与人源恒定区片段连接的重组嵌合抗体表达载体,并基于哺乳动物细胞系,开展两种重组抗体的瞬时转染表达研究。结果 通过缓降血清浓度的方式对OTA杂交瘤细胞进行无血清驯化,实现了体外培养制备OTA单克隆抗体;在此基础上测得OTA单克隆抗体的重链和轻链基因序列,并成功构建了OTA重组全长抗体表达载体(pCDNA3.4-OTA-H/L)和重组嵌合抗体表达载体(p FUSE-OTA-H/L),通过共转染实现了两者在哺乳动物细胞系中的瞬时转染表达;经间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)确定体外培养制备的OTA抗体、OTA重组全长抗体和嵌合抗体均具备特异性结合抗原的能力,三者的...     

玉米赤霉烯酮降解酶基因mbZHD的原核表达及其降解毒素初步研究

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是由镰刀菌属产生的次生代谢物,是极易污染粮食作物的真菌毒素之一。ZEN具有强烈的雌激素样效应及致癌性,给人类和动物的健康造成巨大威胁。本研究在NCBI数据库中进行同源比对,获得了一些ZHD101降解酶的同源基因,其中,1个来源于真菌——杨盘二孢菌(Marssonina brunnea)的蛋白序列与ZHD101具有32%的同源性,基因大小为861 bp。通过化学合成方法得到该全长基因,通过构建E.coli原核表达系统进行蛋白表达,蛋白经亲和色谱纯化后对ZEN分子进行降解活性验证,HPLC结果表明,该蛋白在6 h内对10μg ZEN分子的降解率为98%,酶活为200 U/m L,从而获得了1个新的ZEN降解酶基因。     

黑曲霉及其食品安全领域的赭曲霉毒素问题

黑曲霉(AsPerillium niger)是公认的食品领域的传统发酵菌株,其产品包括各种有机酸、酶制剂等等.但是,最近有越来越多的研究表明某些黑曲霉菌株能够产生赭曲霉毒素(Ochratoxin A,OTA),该毒素是一类极毒的化合物.概述黑曲霉的应用以及产生曲霉毒素的研究近况.     

臭氧降解玉米中赭曲霉毒素A的效果及对玉米脂肪酸的影响

针对粮食贮藏过程中真菌污染造成的食用安全性问题,探讨臭氧在玉米储藏中的应用可行性。以玉米中易污染的赭曲霉毒素A(OTA)为研究对象,在不同质量浓度臭氧,不同处理时间下,考察臭氧对OTA的降解效果,以及对玉米脂肪酸的影响。结果表明：30g/m3臭氧处理120min或者60g/m3臭氧处理90min能将80μg/L的OTA标准品几乎降解完全;利用60g/m3臭氧处理10h能有效的将玉米中污染80μg/kg OTA降解到安全范围(5μg/kg)以下,并且臭氧处理对玉米脂肪酸无显著影响。说明臭氧可有效降解玉米储藏中污染的OTA,并且不会破坏其中的不饱和脂肪酸,初步证明臭氧在玉米储藏中应用的可行性。     

赭曲霉毒素A脱毒菌株的筛选与鉴定

赭曲霉毒素A（ochratoxin A,OTA）是一种广泛分布于各类农产品中的真菌毒素,对人类和动物的健康造成威胁。为探究OTA的体外生物脱毒方法,本实验尝试从小鼠肠道中筛选出脱除OTA的菌株。首先以1 kg体质量添加210?μg OTA的饲料饲喂BALB/c小鼠,收集其粪便,然后利用添加一定质量浓度OTA的LB固体培养基从粪便中逐步筛选出12?株在高质量浓度OTA环境下依然能够大量生长繁殖的菌株,全部接种于LB液体培养基培养20?h后,以高效液相色谱法检测该12?株菌体外脱除OTA的效果。结果发现其中1 株菌YH7能够高效脱除OTA,脱毒效率达到84.6%。从生理学、16S rDNA序列比对等方面分析,最终确定YH7为大肠杆菌（Escherichia coli）。通过单因素优化法确定YH7的最适生长条件为pH?7.5、37?℃和200?r/min的摇床速率。     

制粉和分层研磨对小麦中赭曲霉毒素A的去除效果

以人工染菌的小麦为原料,对小麦进行扫描电镜观察、制粉和分层研磨,分析小麦中赭曲霉菌丝体的分布规律以及加工工艺对赭曲毒素A(OTA)的去除效果。结果发现,赭曲霉菌丝体主要依附在小麦两端的表皮上,并逐步向内延伸。OTA含量为2.26~185.4μg/kg的小麦制得的小麦粉中OTA含量减少了50%~68%。麸皮和细麸中OTA平均总量之和约为72.75%,OTA主要分布于小麦的麸皮和细麸中,而在胚乳中则很少。通过检测小麦经分层碾磨设备后各样品的OTA含量,发现分层研磨可以有效去除小麦中的OTA毒素。经3次研磨后,脱皮率约为18%,脱皮小麦中OTA的含量减少了44%~63.06%。在制粉和分层研磨过程中并没有促进OTA的生成或消除,只是对其进行重新分布。     

玉米中赭曲霉毒素A 的辐照降解效果

目的：探讨γ射线对于玉米中赭曲霉毒素A的辐照降解效果。方法：以受赭曲霉毒素A污染的玉米为研究对象,采用高效液相色谱分析方法定量检测赭曲霉毒素A,比较不同剂量γ射线辐照处理的赭曲霉毒素A的降解率,评价辐照处理后玉米的营养组份。结果：玉米中赭曲霉毒素A经过辐照后,含量明显降低,在10kGy的辐照剂量下,降解率可达50%;经过辐照后玉米的营养组分没有明显变化。结论：辐照能够降解玉米中赭曲霉毒素A,且不会降低玉米品质。     

米曲霉谷氨酰胺酶在黑曲霉中的重组表达与酶学特性

该研究将米曲霉RIB40（Aspergillus oryzae RIB40）来源的谷氨酰胺酶（GahB）在黑曲霉（Aspergillus niger）宿主中分泌表达。基于该研究所建立表型鉴定板与孔板培养的通量鉴定筛选方法成功得到重组表达谷氨酰胺酶的转化子H-GahB,最高酶活力达到1.35 U/mL。为了增加目的基因在宿主中的拷贝数,采用CRISPR/Cas9基因组编辑技术重新构建高拷贝的谷氨酰胺酶表达菌株C-GahB,其酶活力提高到3.56 U/mL,约为H-GahB的2.64倍。进一步采用ARTP诱变技术对C-GahB进行传统诱变育种,获得了谷氨酰胺酶工程菌株A-GahB,其酶活力提升到4.16 U/mL,比出发菌株C-GahB的酶活力提高了0.17倍。纯化后的重组GahB的比酶活达到40.63 U/mg,最适温度为37 ℃,最适pH值为7.0,其在20~40 ℃及pH值5.5~8.0之间稳定性较好。K+对GahB的酶活力具有激活作用,Zn2+和Mn2+则对GahB的酶活力有较为强烈的抑制作用。当盐质量分数为18%时,GahB表现出35.38%的相对酶活力。该研究第一次在黑曲霉中实现了来源于米曲霉RIB40的谷氨酰胺酶GahB的重组分泌表达,为此后对米曲霉谷氨酰胺酶的研究提供了基础。     

重组羧肽酶原B突变体C383A的纯化与性质研究

目的 纯化羧肽酶原B突变体C383A并研究其酶学性质.方法 用DEAE-FF离子交换树脂纯化C383A,测定其动力学参数,温度对酶活性的影响、温度稳定性、最适pH以及pH稳定性等酶学性质,并与野生型比较.结果 纯化后获得高纯度突变体C383A,与野生型相比,催化效率及稳定性均有提高,但与底物的亲和力降低,随着温度的上升催化速率的增长率低于野生型.结论 将重组羧肽酶原B第383位Cys突变为Ala可对酶的性质产生影响,与野生型比较,C383A提高了酶的催化效率及温度和pH稳定性.     

重组羧肽酶原B突变体C383A的纯化与性质研究

目的纯化羧肽酶原B突变体C383A并研究其酶学性质。方法用DEAE-FF离子交换树脂纯化C383A,测定其动力学参数,温度对酶活性的影响、温度稳定性、最适pH以及pH稳定性等酶学性质,并与野生型比较。结果纯化后获得高纯度突变体C383A,与野生型相比,催化效率及稳定性均有提高,但与底物的亲和力降低,随着温度的上升催化速率的增长率低于野生型。结论将重组羧肽酶原B第383位Cys突变为Ala可对酶的性质产生影响,与野生型比较,C383A提高了酶的催化效率及温度和pH稳定性。     

抗赭曲霉毒素A五价纳米抗体的表达及分析

利用霍乱毒素B亚基(B subunit of Cholera toxin,CTB)能自组装形成五元环状结构,将霍乱毒素B亚基与纳米抗体(VHH28)进行融合从而达到纳米抗体多聚化的目的。将重组载体pET25b(+)-CTB-VHH28转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,对诱导剂浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,SDS-PAGE凝胶电泳分析融合蛋白表达情况。结果显示CTB-VHH28为可溶表达,其中单体分子量大小约30 kDa,五聚体分子量大小约150 kDa,均与预测的分子量大小一致;确定了其最优表达条件为:IPTG浓度为0.05 mmol/L,诱导温度为16℃,诱导时间为10 h。经过镍柱纯化后成功得到了纯度较高的五价纳米抗体,表达量为20 mg/L。对其活性进行测定,结果表明CTB-VHH28能与赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)特异性结合,在2.5%甲醇条件下,间接竞争ELISA半抑制浓度(IC₅₀)为0.38 ng/mL。热稳定性及甲醇耐受性结果显示,CTB-VHH28在25~55℃具有良好的热稳定性,反应体系中甲醇浓度低于20%时,竞争抑制率变化不大,具有较好的甲醇耐受性。结论:本研究所制备的五价纳米抗体可以用于OTA检测。     

抗赭曲霉毒素A多克隆抗体的制备

为了制备赭曲霉毒素A多克隆抗体,采用戊二醛法合成赭曲霉毒素A-BSA人工抗原,通过紫外扫描法鉴定半抗原与载体蛋白偶联效果.合成的人工抗原用弗氏佐剂乳化后免疫Balb/c小白鼠,4次免疫后眼球下缘采血,分离血清.试验结果表明,免疫后产生了抗赭曲霉毒素A-BSA的特异性多克隆抗体,抗体效价为1:8100,赭曲霉毒素A的最低...     

新疆酿酒葡萄中赭曲霉毒素A来源菌的筛选及其产毒条件研究

为筛选酿酒葡萄及根系土壤中赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)来源菌及其产毒条件,以新疆四大产区(焉耆盆地、吐哈盆地、天山北麓、伊犁河谷)酿酒葡萄和根系土壤为样品,进行微生物分离纯化和分子生物学鉴定,利用荧光紫外法初筛和酶联免疫法(enzyme-linked immunoassay,ELISA)复筛选择OTA来源菌,并通过单因素试验对其产OTA条件进行探究。筛选结果表明,样品中共分离出霉菌12株,其中,M2(黑曲霉Aspergillus niger)、M7(炭黑曲霉Aspergillus carbonarius)为OTA来源菌,M7产OTA含量较高;单因素结果表明,接种量、温度、酿酒葡萄有无损伤对炭黑曲霉产OTA能力的影响较为明显。该研究为构建葡萄酒OTA污染的预警机制提供了理论依据。     

南极假丝酵母脂肪酶B在黑曲霉中的分泌表达及其硅藻土固定化应用

为提高南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B,CALB）表达量,根据黑曲霉（Aspergillus niger）密码子偏好性设计合成CALB基因,以PnaII/tpi为启动子构建CALB表达载体并转化到黑曲霉HL-1中表达,摇瓶发酵120 h后上清液中重组CALB活力为171 U/mL。研究重组CALB的酶学性质,最适反应温度和pH值分别为50 ℃和8.0,在pH 6.0～9.0和45 ℃以下具有较高的稳定性,10 mmol/L Cu2＋、Zn2＋和0.1 g/100 mL十二烷基硫酸钠强烈抑制酶活力,而1 mmol/L Ca2＋、0.1 g/100 mL山梨醇对酶活力具有非常明显的激活作用。此外,以硅藻土为载体固定CALB,固定化酶活力为187 U/g。将制备的硅藻土-CALB固定化酶用于生物合成己酸乙酯,经反应条件优化后在无溶剂体系中己酸乙酯产率达91%。