肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。      

肉制品中羊源性成分微滴数字PCR法定量检测方法的研究

为准确定量肉及肉制品中羊源性成分的含量,建立了微滴数字PCR定量检测系统。结果显示在一定范围内羊肉质量与DNA含量、DNA含量与DNA拷贝数之间均呈现明显的线性关系,选择DNA含量作为中间换算值,计算出羊肉的质量与拷贝数之间的关系为M_羊=0.03C+0.69。应用建立的微滴数字PCR定量检测方法对已知质量分数的羊肉模拟混合样品进行检测,发现无论在两两混合还是多肉样混合的情况下,其含量偏差最大为1.52%,具有较强的抗干扰能力。通过对市售样品的检测,显示该方法能够准确检测出不同样品中羊肉的含量,并发现可能存在掺假现象,说明该检测方法具有良好的市场应用前景。本实验建立的微滴数字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分检测方面具有较大的应用潜力,为肉制品日常检测及是否掺假提供有力的科学依据。     

微滴式数字PCR对肉制品中羊肉和猪肉定量分析

为了实现肉制品中羊肉和猪肉的量化研究,本文应用微滴式数字PCR对肉制品进行定量检测。通过在看家基因上设计单拷贝特异性引物,能更好的鉴别是人为因素的掺假还是在加工过程中无意的带入。根据dd PCR的结果显示,在一定范围肉质量和DNA的浓度,DNA浓度和DNA拷贝数(C)成现一定的线性关系。通过人为掺假及市售样品检测以验证此方法。以DNA浓度作为中间换算值,得到肉质量和DNA拷贝数之间的换算关系M_羊=0.12C-10.6 M_猪=0.07C+4。通过对已知掺假比例的肉样及市售样品进行检测,能够较好的得到掺假肉的质量。目前市场上存在一定的掺假现象且该检测方法具有一定市场应用前景,本文建立的微滴式数字PCR在羊肉和猪肉及其制品中的掺假检测具有较强的应用潜力,对目前混乱的肉制品掺假的市场监管提供了科学的依据。     

多重微滴式数字PCR定量检测市售核桃乳中核桃、大豆源性成分

目的:为市售核桃乳中核桃源及主要掺杂物种大豆两种源性成分建立准确、快速定量检测方法。方法:从植物组织(核桃、大豆)或是植物蛋白饮料(核桃乳饮料)提取核酸后,主要采用多重微滴式数字聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术,测算单位质量核桃和大豆的目的基因拷贝数比值,建立基因拷贝数与质量之间的关系,进而利用该比例关系换算出植物蛋白饮料中核桃和大豆的投料量,以实现对植物蛋白饮料中植物源性成分的定量检测。结果:基于多重微滴式数字PCR定量检测市售产品中大豆和核桃源性组分的方法,引物探针特异性好,目标物种间无交叉反应;灵敏度高,核桃中掺杂大豆的质量检测限为0.5%,相对误差为5.6%。将单一源性5种不同质量下靶基因拷贝数之比与5种不同比例混合源性靶基因拷贝数之比通过重复3次检测,综合比较并拟合后得到单位质量下拷贝数(C_(大豆)/C_(核桃)=1.771 1)的换算比例值。在从商品超市中抽取的11份不同品牌的核桃乳中(仅含核桃一种植物源成分),多重微滴式数字PCR方法检测显示:11份样品均检出核桃源性成分,6份样品检出大豆源性成分,其中4份样品中大豆与核桃质量之比高于10%,判断存在掺杂使假;2份样品大豆与核桃质量之比低于0.2%,极低的检出量推断为工艺沾染。结论:采用多重微滴式数字PCR准确、快速的定量方法可作为鉴别核桃乳中掺杂使假问题的有效手段。     

微滴式数字PCR与实时荧光PCR检测羊肉制品中羊源和猪源性成分方法的比较

参考外文文献中羊肉和猪肉的特异性引物及TaqMan探针,分别建立一种定量检测羊肉制品中羊源和猪源性成分的微滴式数字PCR方法,并将该方法与标准SN／T 2051－2008中实时荧光PCR方法做对比来检测3份羊肉制品中的羊源和猪源性成分。结果表明,实时荧光PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源性成分的Ct值分别是14?424／19?214、18?345／20?147、17?321／20?542;猪源性成分的 Ct 值分别是18?923／34?483、20?121／28?963、20?352／33?851;微滴式数字PCR方法检测5号、9号、23号样品中的羊源和猪源性成分的DNA拷贝数分别为236／0 copies／μL、421／0?3copies／μL、402／0?11copies／μL。表明两种方法均能检出3份样品中均含有羊源和猪源性成分,而微滴式数字PCR方法能够对DNA模板定量分析。结论：在肉种成分真伪鉴定上,微滴式数字PCR方法较实时荧光PCR方法更科学、准确。     

基于实时荧光定量PCR和数字PCR的肉制品中牛源性成分检测

为了能够快速有效的检测出肉制品中牛源性成分,采用实时荧光定量PCR和数字PCR检测方法,检测肉制品中牛源成分。先依据牛肉单复制基因组特异区域,通过多序列比对设计特异性引物与探针,再利用苯酚-氯仿法提取标准品基因组DNA,确立实时荧光定量PCR和数字PCR两种方法的反应条件,测定DNA模版纯度及浓度可得实验提取的DNA溶液不含杂质,在此基础上构建牛源性成分荧光定量PCR标准曲线,检测两种方法的特异性、抗干扰性与肉制品中牛源性成分。分析实验结果可知,引物与探针在两种方法中均对牛肉有荧光信号显示,两种方法具有牛源性特异性,检测数值与实际样品数值基本一致,且两种方法抗干扰性较好,当存在其他肉类干扰时,仍可准确监测出牛源性,两种方法的最大误差分别为3.8%和4.0%;可定量检测不同肉制品中牛源性成分,两种方法均未检测出样品10牛肉丸中牛源性成分,验证了市面上确实存在假肉情况。说明所用方法能够准确、快速地检测出肉制品中的牛源性成分,适用于市场中肉制品的检测,对保障消费者的权益和健康具有十分重要的意义。     

利用微滴式数字PCR技术检测大豆毛油中的转基因成分

我国是转基因大豆的进口大国,由转基因大豆加工而成的大豆油成为进入消费者生活的食用油,判定食用的大豆油是否含有转基因成分,是国家监管部门和公众消费者密切关心、关注的问题。大豆油在制备精炼过程中破坏了大豆的DNA,造成检验时DNA富集难度增加,严重影响了大豆油转基因成分检测的准确度。到目前为止,国家已经颁布的标准中没有涉及转基因大豆油的检测标准。本研究利用高灵敏度、精确度的数字PCR技术,并通过优化大豆毛油DNA提取方法和PCR反应体系,对大豆毛油样品进行外源转基因成分检测。检测结果显示,大豆毛油外源转基因成分被成功检测到。实验结果表明,本研究建立的大豆毛油转基因成分检测方法准确可靠,可进行推广应用。     

微滴数字PCR方法检测畜肉食品中鸭源性成分

目的利用微滴数字PCR技术,建立鸭源性成分的快速、特异、灵敏检测方法。方法根据鸭线粒体基因全序列设计的引物及探针,利用微滴数字PCR进行扩增,建立鸭源性成分检测方法;以市场中常见畜禽肉为参考物种作微滴数字PCR特异性检测;以羊肉为干扰物观察微滴数字PCR的抗干扰性;将鸭肉DNA进行梯度稀释,对方法灵敏度进行检测。结果该方法能够有效对鸭源性成分进行检测,特异性强,灵敏度高,并且其他物种成分的存在对方法灵敏度检测没有影响。结论该方法特异性强,灵敏度高,可以实现畜肉食品中的鸭源性成分检测。     

应用微滴式数字聚合酶链式反应定量检测牛肉制品中的猪源性成分

参照GB/T 25165—2010《明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法 实时荧光聚合酶链式反应法》,以牛的生长激素（growth hormone,GH）基因和猪的朊蛋白（prion protein,PRNP）基因2 种核基因为靶基因合成特异性引物和探针。理论推导单位质量牛肉的GH基因与猪肉PRNP基因拷贝数之比为一固定值,通过微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）方法对该固定值进行检测和验证,并以该固定值对牛肉/猪肉人工混合样本和市售牛肉制品中的猪肉成分进行定量检测。结果表明：该方法具有良好的准确性及可重复性;牛肉中掺杂猪肉质量分数在5%～99%范围内时,检测结果绝对误差小于1.28%,变异系数小于6.5%,猪肉成分的回收率为99.09%～102.80%;20 份牛肉制品中,4 份检出猪肉成分,其中3 份的相对含量为29.19%～98.15%,1 份为0.12%（低于本方法检出限5%）。因此,ddPCR方法可以较好地应用于牛肉制品中掺杂猪肉成分的定量检测。     

微滴式数字PCR定量检测杏仁露中杏仁、花生源性成分

为定量分析市售杏仁露中杏仁源性成分和掺假花生源性成分的含量,本研究基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）技术建立准确的检测方法。从杏仁、花生的植物组织提取核酸后,建立植物源性成分质量（M）与DNA拷贝数（C）之间的线性关系。ddPCR研究结果显示,在一定范围内杏仁、花生的质量和DNA含量、DNA含量和DNA拷贝数均呈显著的线性关系,以DNA含量为中间值换算得出公式：M杏仁=0.13C＋1.24,M花生=0.081C－0.63。通过已知混合比例的两物种掺假模型验证该公式的准确性和适用性,并对市售的12 个杏仁露样品进行检测。研究表明,该方法准确可靠,能达到精准定量。本研究建立的ddPCR方法可有效甄别杏仁露中的花生源性成分为无意沾染或有意掺杂,在杏仁露中杏仁和花生含量的定量检测方面具有较大应用潜力,为植物蛋白饮料的市场监管提供技术支持。     

一种基于双重ddPCR的肉制品中牛源性成分的定量分析方法

将低价肉类原料掺入高价肉制品是一种典型的肉类掺假方式,为准确鉴别牛肉及牛肉制品的真伪,建立一种基于双重微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）的牛源性成分定量分析方法。通过对14 种动物的Beta-actin单拷贝基因序列进行分析,设计牛源性特异性引物、探针与动物源性成分通用引物、探针并建立双重ddPCR体系,推导出牛源性成分质量与其特异性扩增拷贝数之间的计算公式,对牛源性成分进行定量检测该方法得到牛源性成分质量M牛（mg）与其特异性扩增拷贝数浓度C牛（copies/μL）之间的计算公式为M牛=0.033C牛＋2.37,对已知牛肉质量的混合肉样品与不同部位的牛肉样品进行检测,结果显示牛肉定量检测值与实际质量基本一致。同时拷贝数相对含量可辅助判断肉制品中是否存在非牛源性的其他动物源性成分掺假。对市售样品的检测发现,存在目标肉样含量不达标以及不同程度的动物源性成分等掺假现象,说明该检测方法可为牛肉制品掺假量化判定和混合源性产品分级鉴定提供技术支撑。     

基于微滴式数字聚合酶链式反应技术的肉制品中鸭源性成分的定量检测

为实现肉制品中鸭源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)技术,以鸭生长激素(growth hormone,GH)基因为靶基因,建立肉制品中鸭源性成分的定量检测方法.结果表明:所建立的ddPCR方法能特异性检测鸭源性...     

微滴式数字聚合酶链式反应对香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量分析

为实现肉制品中动物源性成分的定量检测,基于微滴式数字聚合酶链式反应（droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR）,以鸡的转化生长因子β-3基因、猪的朊蛋白基因和牛的生长激素基因为靶基因,建立香肠制品中鸡、猪、牛源性成分的定量检测方法。结果表明：所建立ddPCR方法特异性强,能特异性检测相应的鸡、猪、牛源性成分;根据肉粉质量（mg）与DNA质量浓度（ng/μL）、DNA质量浓度（ng/μL）与基因拷贝数浓度（copies/μL）之间的线性关系,得到鸡肉粉、猪肉粉和牛肉粉质量（x1）与基因拷贝数浓度（ y 2） 之间的关系式为： 鸡：x1=（n*y2）/273.946 - n/886.557 + 0.216; 猪：x1=（n*y2）/64.950 + n/60.644 + 0.215; 牛：x1=（n*y2）/62.839 + n/12.646 + 1.218（n为稀释倍数）;基于建立的ddPCR方法对64 份市售不同种类香肠样品进行检测,在1 份原料标识仅为“猪肉”的香肠中检出鸡源性成分含量为18.68%。本研究建立的ddPCR方法能够实现香肠中鸡、猪、牛源性成分的准确定量检测,并可以此判断“蓄意掺假”或“无意带入”。     

水产品中创伤弧菌ddPCR定量方法的建立

选取创伤弧菌单拷贝基因met为靶基因,设计引物探针,建立对创伤弧菌准确定量的微滴式数字聚合酶链式反应(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法,并进行特异性、灵敏度和重复性实验,同时与实时PCR(real-time PCR)方法进行比较。结果显示,所建立的ddPCR方法可以快速、高效地检测出创伤弧菌,细菌纯培养物中其定量限可达323拷贝数/mL,检测限可达61拷贝数/mL,人工污染牡蛎样品中能最低能检测到1.13×102拷贝数/g的目标菌。对人工污染样品中目标菌的检测,ddPCR的定量结果约为平板计数结果的1.4倍,比real-time PCR方法的检测更加稳定准确。本研究建立的ddPCR检测方法能快速准确、特异、灵敏地定量检测创伤弧菌。     

基于单拷贝核基因的数字PCR定量检测肉制品中羊源性成分

GeneBank搜索牛、绵羊、山羊、猪、马、驴、鸡、鸭、鹅、火鸡、狗、猫、鼠、兔、貂等15种动物的单拷贝核基因组序列信息,应用生物信息学分析筛选15种动物共有的种间保守区域,设计一对可同时扩增15种动物源性DNA的内参基因引物和探针;同时分析筛选绵羊和山羊共有且和其余动物种内特异性区域,设计一对只能扩增羊源性DNA的特异性基因引物和探针。基于微滴数字PCR技术,引入内参基因校正羊种属特异性基因测定方法,建立科学准确的肉制品中羊源性成分量化判定方法。结果表明,所建立方法具有良好的特异性和通用性,内参基因和羊种属特异性基因的最低检出限分别为32和26 copies/μL,模拟添加样品的正确度偏差均值为8.66%,符合数字PCR方法制定指南要求不得大于25%,说明量化判定方法结果具有较高的准确性。     

液滴数字PCR定量检测鸭血制品中掺假成分

鸭血制品作为市场常见商品,掺假现象十分严重。选取鸡、鸭、鹅基因组中的特异性单拷贝基因为靶基因,设计引物和探针,建立鸡、鸭、鹅血微滴数字PCR定量检测方法。使用人工混合样品对该方法的准确性进行验证,同时通过检测市售样品来验证方法的适用性。实验结果表明,样品含量在1~1000 μg/mg时,靶基因拷贝数与样品质量之间具有良好的线性关系,检测限和定量限分别为5 μg/mg和1 μg/mg。通过人工混合样品和市售样品检测证明,该方法具有良好的准确性和适用性,可用于对鸡、鸭、鹅血制品的定量检测。