铬离子单克隆抗体的制备及食品总铬含量检测胶体金免疫层析试纸条的研制

目的:制备三价铬离子螯合物单克隆抗体(Cr~(3+)-EDTA m Ab),研制胶体金免疫层析试纸条(Cr-Strip)。方法:用异硫氰酯法合成Cr~(3+)-i EDTA-BSA,UV和ICP-AES进行鉴定;细胞融合技术筛选Cr~(3+)-EDTA m Ab细胞株,体内诱生腹水法制备Cr~(3+)-EDTA m Ab,并对其特性进行分析;应用Cr~(3+)-EDTA m Ab研制Cr-Strip,并测定其性能。结果:筛选出3株杂交瘤,最好的是2A11G5,Ka为2.69×109L/mol,对Cr~(3+)-EDTA的IC50为9.84μg/L,与其他重金属离子无交叉反应;Cr-Strip的检测时间为10 min,检测限为5μg/L,其检测结果与ICP-AES符合率为100%。结论:制备出了高质量的Cr~(3+)-EDTA m Ab,研制出更为灵敏的Cr-Strip。     

呋喃唑酮代谢物单克隆抗体和胶体金免疫层析试纸条的研制

本研究旨在建立一种快速检测呋喃唑酮代谢物残留的方法。试验用呋喃唑酮代谢物的衍生物（CPAOZ）与牛血清白蛋白（BSA）的偶联物免疫小鼠,利用单克隆抗体技术制备杂交瘤细胞,用间接ELISA和间接竞争ELISA法对阳性克隆进行筛选。单克隆细胞株诱生腹水后,经纯化即为单克隆抗体,用于胶体金标记,制备呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条。融合后得到2株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,其中4G3纯化后的抗体效价达到1:100万,对CPAOZ的50%抑制质量浓度（IC50）为1.7 μg/L,亲和常数Ka=1.6×109 L/mol。该抗体制备的胶体金试纸条的检测限为4 μg/L,与其他3种硝基呋喃代谢物的衍生物CPAHD、CPSEM和CPAMOZ均不存在交叉反应,对样品的检测与高效液相色谱结果一致。本研究制备了抗呋喃唑酮代谢物特异性单克隆抗体,并研制了以单抗为基础的胶体金免疫层析试纸条,能够实现呋喃唑酮代谢物残留的快速、灵敏的检测。     

基于量子点建立铅镉快速串联检测方法

将鼠抗Cd2＋-IEDTA单克隆抗体和鼠抗Pb2＋-IEDTA单克隆抗体分别与包载CdSe/CdS量子点聚苯乙烯微球偶联,建立一种可快速检测铅镉的量子点荧光定量串联卡及免疫层析竞争检测方法。串联卡的最佳反应时间为5?min,可检测的Pb2＋和Cd2＋质量浓度范围分别为1～500?ng/mL和1～400?ng/mL,检测变异系数小于10%;检测特异性良好,与其他金属离子无明显交叉反应;利用该方法与电感耦合等离子体-质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry,ICP-MS）法进行肉类食品检测对比,检测结果与ICP-MS相关性良好。该检测方法为同时定量检测铅镉提供快速简便的有效途径,适用于监测肉中Pb2＋和Cd2＋含量是否超标。     

高灵敏度磁荧光免疫层析试纸模式构建及在呕吐毒素检测中的应用

构建基于磁荧光纳米材料的免疫层析试纸模式,弥补现在免疫层析技术的不足,为更灵敏的免疫学快速检测提供技术支撑。以呕吐毒素（deoxynivalenol,DON）为靶标,采用溶剂热法制备羧基修饰的超顺磁颗粒,碳二亚胺法将磁颗粒、绿色荧光蛋白及DON单克隆抗体进行偶联,一步法制备磁荧光抗体探针,以DON人工抗原（DON-BSA）为检测线建立磁荧光免疫层析试纸。同时用胶体金标记DON单克隆抗体,以DON-BSA为检测线建立胶体金免疫层析试纸;制备的磁荧光抗体探针具有很好的磁性、荧光特性及抗体反应性,基于该探针成功制备了DON磁荧光免疫层析试纸,该试纸回归方程为y=－0.562x＋0.921,R2=0.990,IC50为5.611 ng/mL,检出限为1.089 ng/mL;制备了DON胶体金免疫层析试纸,该试纸裸眼检测灵敏度为500 ng/mL;定量检测回归方程为y=－0.543x＋1.485,R2=0.991,IC50为65.16 ng/mL,检出限为11.94 ng/mL。DON磁荧光免疫层析试纸的灵敏度是胶体金免疫层析试纸的10.96 倍。本实验建立的磁荧光免疫层析试纸模式可以同时实现样品的富集及荧光信号检测,提高检测灵敏度,并成功用于DON的检测,为磁荧光纳米颗粒广泛应用于免疫层析领域提供参考。     

甲硝唑人工抗原的合成及鼠源多抗的制备

为了获得效价高、特异性好的甲硝唑（metronidazole,MNZ）的小鼠多抗血清,采用琥珀酸酐法将甲硝唑上的羟基改造成羧基,然后通过碳二亚胺法把改造后的甲硝唑分别与牛血清白蛋白（albumin from bovine serum,BSA）和卵清蛋白（ovalbumin,OVA）进行偶联,制备免疫原MNZ-BSA和包被原MNZ-OVA。经紫外扫描和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳初步鉴定偶联成功。将免疫原MNZ-BSA分成20 μg/只和50 μg /只2 个剂量分别免疫8 周龄的BALB/c小鼠。获得了效价高、特异性好的小鼠多抗血清,效价均达到1∶104以上,IC50值为61.39 ng/mL。     

大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子单克隆抗体的制备与鉴定

为制备免疫学特性良好的大豆Bowman-Birk胰蛋白酶抑制因子（BBI）单克隆抗体（mAb）,以50 μg/只的免疫剂量将BBI免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA和间接竞争ELISA试验鉴定多抗血清效价和敏感性。选择血清效价和敏感性较优的小鼠进行细胞融合,多次筛选得到分泌BBI mAb的稳定杂交瘤细胞株。采用体内诱生腹水法制备BBI mAb并对其免疫学特性进行鉴定。结果表明：1号小鼠经免疫后效价最高且敏感性最好,半数抑制浓度（IC50）为868.58 ng/mL。经细胞融合筛选得到5株杂交瘤细胞,其中3B7-B10 mAb效价达到1 ∶ 4.096×105以上,亚型为IgG1型,IC50为83.07 ng/mL,具有亲和力较高且特异性强的优点,表明所制备的mAb免疫学特性良好,能够为建立大豆及其制品中BBI的免疫学检测方法提供良好的抗体基础。     

柠檬黄色素免疫学检测方法的研究

将柠檬黄分子与卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)偶联为检测原和免疫原,免疫Balb/c 小鼠,通过杂交瘤技术获得分泌抗柠檬黄单克隆抗体杂交瘤细胞株3D4,纯化腹水得到单克隆抗体,建立间接竞争ELISA 检测方法,回归方程和相关系数分别为：y= － 40.134x+133.46,R2=0.9692,最低检出浓度为0.36μg/L。该方法与柠檬黄色素常用的检测方法薄层分析及分光光度计法相比,检测限低、耗时短、成本低,适用于大批量样品检测。     

酚酞单克隆抗体的制备

目的 建立免疫学快速检测减肥类保健食品中非法添加的酚酞, 制备酚酞单克隆抗体并进行评价。方法 利用碳二亚胺(carbodiimide, EDC)法合成免疫原和包被原, 用免疫原免疫Balb/C小鼠, 取小鼠脾脏与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合。采用竞争结合双阳性两步筛选法, 筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞, 利用有限稀释亚克隆方法得到单株细胞; 采用体内诱生法制备腹水型单克隆抗体。利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水型抗体进行纯化, 利用酶联免疫吸附法鉴定纯化后的抗体。结果 成功合成了酚酞-BSA免疫原和酚酞-OVA包被原, 筛选获得酚酞杂交瘤细胞株FT/BSA/2019, 单克隆抗体的效价1×105。结论 本研究初步建立了特异性高的酚酞单克隆抗体的制备方法。     

纳米SiO2富集水样重金属镉-hicELISA检测方法的建立

目的:探究纳米SiO₂富集分离水样中Cd2+的条件,制备抗Cd2+单克隆抗体,建立水样中痕量Cd2+异源性间接竞争ELISA（heterologous indirect competitive ELISA,hicELISA）快速检测方法。方法:以纳米SiO₂富集、EDTA-2Na竞争洗脱Cd2+,ICP法测定处理过程中的Cd2+含量。人工合成Cd-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠,制备Cd2+单克隆抗体。人工合成异源性包被抗原,建立镉离子hicELISA检测方法。结果:纳米SiO₂对Cd2+的吸附容量为13.3 mg/g,富集倍数可达20倍,EDTA-2Na可有效洗脱被富集的Cd2+。以Cd-ITCBE-BSA为免疫原,小鼠血清效价达到1:1.28×104;腹水效价为1:2.0×105,亲和力Ka为8.1×108 L/moL。以Hg-ITCBE-OVA包板建立的hicELISA检测限为2.9 μg/L,与Hg2+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Cr3+、Mo6+、Fe3+、Co2+ 无明显交叉反应。在湖水、自来水、超纯水样品中镉的加标回收率为92.47%~102.86%。结论:建立的纳米SiO₂富集重金属镉-hicELISA检测方法灵敏、特异、准确,能用于水样中镉离子的检测。     

牛β-乳球蛋白胶体金免疫层析试纸条的研制及检测应用

研制了一种可快速检测羊乳及制品中牛源β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-lg)的胶体金免疫层析试纸条。通过杂交瘤技术制备牛β-lg特异性单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),利用柠檬酸钠还原氯金酸,形成30 nm胶体金颗粒,并用于标记牛β-lgmAb。采用竞争法研制免疫层析试纸条,将胶体金标记的牛β-lgmAb包被于金标垫,牛β-lg和羊抗鼠IgG标记于硝酸纤维素膜分别作为检测线(T线)和质控线(C线),牛β-lg和二抗的最佳包被浓度均为1.0 mg/mL。制得的单克隆抗体纯度都在90%以上,效价均在10000以上且特异性较好。该试纸条对牛β-lg的检测限(limit of detection,LOD)值为3.13μg/mL,对牛源α-CN,牛源β-CN,牛源κ-CN,牛源α-LA,BSA均未产生交叉反应,对脱脂羊乳粉中掺杂脱脂牛奶粉的LOD值为5%,并用该方法对市售羊奶及配方羊奶粉进行分析,检测结果与商品化的ELISA试剂盒一致。该方法前处理快速简单,可在5 min内对牛β-lg进行检测,可用于羊乳制品的现场快速检测。     

鲢鱼重组Cystatin的原核表达、鉴定及对铜绿假单胞菌的抑制作用

本实验主要对鲢鱼半胱氨酸蛋白酶抑制因子Cystatin进行原核表达和纯化鉴定,并研究重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果。首先用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）诱导转入pET-30-Cystatin的E.coli BL21（DE3）表达重组Cystatin蛋白,经Ni2+-NTA镍离子亲和层析对其进行纯化,该重组蛋白在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示单一条带,分子质量约20.6 kD,在TSK-GEL G2000SW凝胶过滤高效液相色谱上呈单一活性峰,纯度为94.27%,经标准曲线计算其分子质量为20.9 kD;其次,利用抑制剂滴定曲线法,以偶氮酪蛋白为底物,确定重组Cystatin对木瓜蛋白酶（45.375 μmol）的一个抑制活性单位为0.718 μg;最后通过滤纸片扩散法鉴定鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果,结果表明Cystatin的添加量为20、60、120、200 U/片时,抑菌圈直径分别为8、9、13、26 mm。鲢鱼重组Cystatin对铜绿假单胞菌的抑菌效果呈剂量依赖关系。     

抗呋喃唑酮单克隆抗体的制备及其应用

为实现呋喃唑酮（furazolidone,FZD）的快速定量检测,本研究制备了抗FZD全抗原的单克隆抗体,建立了抗FZD的单克隆抗体酶联免疫检测方法。结果表明,FZD单克隆抗体在质量浓度为10～500 ng/mL范围具有较好的线性,IC50值为0.06 μg/mL,最低检测限为6.92 ng/mL,对于其他硝基呋喃类抗生素及其代谢物均不存在交叉反应。该方法重现性较好,平均误差为6.54%,回收率为76.84%～88.31%。     

基于信号增敏型试纸条三聚氰胺超灵敏检测方法

通过胶体金免疫层析技术建立一种能便捷、快速、特异检测食品中三聚氰胺的超灵敏快速检测技术。在传 统的基于竞争法层析试纸条的基础上增加一个增强垫组装成增敏型试纸条,在识别垫和增强垫上分别使用25 nm和 15 nm胶体金,使其在传统型试纸条的基础上对三聚氰胺的检测灵敏度大大提高。结果表明：增敏后的试纸条可在 10 min内实现食品中三聚氰胺的快速检测;实验条件下检测灵敏度为0.5 μg/L,是传统检测灵敏度10 μg/L的20 倍; 实际样品中检测范围为0.1～5 μg/L,检测灵敏度为1 μg/L,相比于传统检测灵敏度提高了5 倍。     

血根碱清除自由基及抑制生物大分子氧化的作用

目的：评价血根碱的体外抗氧化活性,为血根碱作为天然抗氧化剂的应用提供理论依据。方法：采用DPPH自由基清除法测定血根碱的体外抗氧化能力;采用Cu2+/H2O2和AAPH体系诱导牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）氧化损伤和羰基化损伤模型,研究血根碱对上述损伤的保护作用;采用TBA法分别测定血根碱对FeSO4诱导的大豆卵磷脂氧化损伤的抑制作用,及AAPH诱导的鲱鱼精DNA氧化损伤的抑制作用。结果：血根碱可有效清除DPPH自由基,且呈浓度依赖性,在100 μmol/L时清除率为85.94%;1～100 μmol/L的血根碱可显著保护Cu2+/H2O2及AAPH体系诱导的BSA损伤;10～100 μmol/L的血根碱可显著保护由Cu2+/H2O2体系诱导的BSA蛋白羰基化,当浓度为0.1～100 μmol/L时可显著保护由AAPH诱导的BSA蛋白羰基化;血根碱浓度在6.25～100 μmol/L范围内均可显著抑制由FeSO4及AAPH诱导的大豆卵磷脂及鲱鱼精DNA的氧化损伤。结论：血根碱可有效清除自由基及保护蛋白氧化损伤和羰基化损伤,亦可显著抑制脂质及DNA氧化损伤。     

微波密闭消解-ICP-AES同时测定贼小豆中18 种矿物质元素

为探讨郑州地区野生贼小豆中微量元素的组成、含量和分布特性,充分开发利用贼小豆自然资源,用微波 密闭消解-电感耦合等离子体发射光谱法同时测定了贼小豆样品中Al、Ba、Ca、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg等18 种 微量元素。结果表明：在优化条件下,待测各元素间相互干扰较小,18种元素在一定范围具有良好的线性关系,相 关系数（r）均不小于0.995 0,检出限范围为0.000 1～0.035 μg/mL,定量限范围为0.000 17～0.058 μg/mL,平均回收率 为97.08%～113.06%,相对标准偏差为0.14%～3.2%（n=6）。该法所用样品和消解剂量少,消解完全、快速省时,待 测元素不易挥发损失,可同时测定18 种矿物质元素,工作效率较高,用于贼小豆样品的测定,结果令人满意。     

大籽蒿精油化学成分及其抗菌抗氧化活性

采用水蒸气蒸馏法提取采自西藏地区藏药大籽蒿的精油,通过气相色谱-质谱联用技术分析鉴定其化学成分,采用峰面积归一化法确定各成分的相对含量;并对大籽蒿精油体外抑菌能力和抗氧化能力进行测定。大籽蒿精油中共鉴定48 种化合物,占精油总量的95.36%,主要成分为红没药醇、兰香油奥、α-水芹烯、棕榈酸和薰衣草醇等;体外抑菌结果表明,大籽蒿精油对枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌和新型隐球菌具有较强的抑菌效果,而对大肠杆菌具有较弱抑菌效果;体外抗氧化活性结果表明大籽蒿精油对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐自由基和羟自由基具有一定的的清除能力,且清除效果强于VC。     

新霉素半定量胶体金试纸条的研制

建立了一种快速、简单的检测牛乳中新霉素残留量的胶体金免疫层析法。将不同浓度的新霉素人工合成完 全抗原包被在硝酸纤维素膜上作为检测线（T1、T2线）,与待测牛乳样品中的新霉素竞争结合新霉素单克隆抗体- 胶体金标记物,通过两条T1、T2线显色情况使传统新霉素胶体金试纸条由定性检测准确到半定量检测。试纸条对 牛乳样品的半定量检测限分别为200 μg/kg和400 μg/kg,该检测限满足欧盟及国家对新霉素检测的需求,且检测牛 乳样品能够满足现场快速检测的要求,为现场快速检测牛乳中新霉素残留提供了更精确的参考依据。     

Competitive photocatalytic oxidation of Cu(II)--EDTA and Cd(II)--EDTA with illuminated TiO2

Competitive photocatalytic oxidation (PCO) of mixtures of Cu(II)-EDTA and Cd(II)-EDTA was studied with variation of molar ratio of these two complexes (1 x 10(-4):0, 8 x 10(-5): 2 x 10(-5), 5 x 10-5:5 x 10(-5), 2 x 10-5:8 x 10(-5), 0:1 x 10(-4) M) and in the pH range of 4-8. PCO rates for each compound can be described using a combined aqueous + adsorbed pathway: -dC/dt = k1Caq(1+ k2Caq)+ kadsCads. This expression is valid under both noncompetitive and competitive conditions. Differences in rates under competition result from differences in the partitioning of the two species between the TiO2 surface and the aqueous phase. Total initial complex degradation rates (rTT), obtained by summation of the total destruction rates for Cu(II)-EDTA and Cd(II)-EDTA, were relatively constant at pH 4 and 5 for all ratios. At these pH values, contribution of adsorbed pathways to rTT was important, and rates were similar to those of the aqueous phase pathways. From pH 6 to 8, the degree of adsorption, and thus the adsorbed pathway rate, diminished. Through the adsorbed pathway, no difference in rate constants was found between Cu(II)-EDTA and Cd(II)-EDTA; Cd(II)-EDTA is somewhat more reactive through the aqueous phase pathway.     

重庆地方名柚果肉酚类物质含量及其抗氧化活性分析

通过紫外分光光度计法和高效液相色谱法分别测定10 种重庆地方名柚成熟果实囊衣、汁胞2 个部位的总酚、总黄酮含量及类黄酮、酚酸组分和含量,并采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、铁离子还原能力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）测定、2,2’-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS）3 种方法对其抗氧化活性进行评价。结果表明：囊衣的总黄酮含量和类黄酮含量较高,‘琯溪蜜柚’总黄酮含量最高达10.97 mg/g,类黄酮中地奥司明含量最高,均值为1 000.72 μg/g,其含量最高为‘五布柚’,达到2 366.77 μg/g;汁胞的总酚含量和酚酸含量较高,‘真龙柚3号’总酚含量最高达8.84 mg/g,酚酸中没食子酸含量最高,均值为1 040.16 μg/g,其含量最高为‘长寿沙田柚’,达到1 325.89 μg/g。利用DPPH法和FRAP法测定2 个部位抗氧化活性,汁胞高于囊衣,ABTS法则囊衣高于汁胞。综合抗氧化能力指数表明,‘琯溪蜜柚’囊衣、‘梁平柚78-8’汁胞的抗氧化活性最强。通过本研究,不仅能够了解重庆地方名柚果实囊衣、汁胞部位酚类物质组分和含量,同时为柑橘酚类物质的应用选择提供了一定的理论依据,促进了柑橘果品营养学的发展。     

CdTe量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗

以巯基乙酸作为稳定剂,利用水热反应制备了水溶性的高荧光CdTe量子点,量子产率为54.961%。研究了该量子点在1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺的作用下与抗克伦特罗抗体的共价连接。结果表明：该量子点与克伦特罗抗体连接后体系的荧光强度和吸光度均增强,且峰位均未发生明显移动,F/P值为4.20。将该偶联反应物CdTe-Anti CLE pAb作为荧光标记物,组装出一种用于检测克伦特罗的荧光免疫试纸条,最低检测限达0.5 μg/L,与酶联免疫吸附法进行对比,该试纸条能够实现对克伦特罗的快速检测。