菜籽蛋白水解物体外和细胞内抗氧化性评价及氨基酸分析研究

以“双低”油菜籽秦优7号为原料,碱溶酸沉法获得菜籽分离蛋白后进一步用Alcalase2.4L酶解得到菜籽蛋白水解物（rapeseed protein hydrolysates,RPHs）;采用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶柱（Sephacryl S-100HR）对RPHs进行分离纯化,得到3 个组分;采用抗氧化能力指数（oxygen radical absortion capacity,ORAC）方法以及细胞抗氧化活性（cellular antioxidant capacity,CAA）的方法分析筛选得到抗氧化性最好的组分3。结果表明组分3的ORAC值为（1610.38±112.51）μmol TE/g;CAA值为（124.66±2.18）μmol QE/g,EC50值为（57.84±3.38）μg/mL;在此基础之上,对组分3进行氨基酸分析以及电泳分析,表明其抗氧化性与分子质量分布及氨基酸组成可能存在一定关系。     

玉米谷蛋白抗氧化肽的分离纯化与活性研究

采用Alcalase蛋白酶酶解从玉米脱脂蛋白粉中分离得到的玉米谷蛋白,对酶解产物采用超滤、凝胶过滤层析和高效液相色谱法分离纯化玉米谷蛋白抗氧化肽,并研究其抗氧化活性。结果表明,Alcalase蛋白酶酶解玉米谷蛋白获得的抗氧化肽分子量主要集中在低于1 kDa,其DPPH自由基和羟自由基清除率分别为80.46%、81.36%。凝胶过滤层析得到抗氧化活性较高的组分P6、P7和P8,其DPPH自由基清除率分别为32.05%、24.43%、14.19%,多肽含量分别为0.638、0.253、0.158 mg/mL。高效液相色谱对这3个组分进一步分离纯化分别得到主要组分。     

紫苏粕蛋白抗氧化活性肽的制备、分离纯化及序列鉴定

以紫苏粕粉为原料，使用碱性蛋白酶进行水解反应，制备抗氧化活性肽。采用超滤离心、凝胶过滤色谱和反相色谱等分离纯化手段对其富集。结果表明，相较其它3种蛋白酶，碱性蛋白酶Alcalase对紫苏粕蛋白的水解程度最高，约为(25.94±0.21)%；碱性蛋白酶作用紫苏蛋白后的酶解产物的抗氧化活性最好，对DPPH自由基清除率约为(91.01±0.73)%。酶解上清液经超滤离心分离后最小分子质量组分F1(小于3 ku)抗氧化活性最强，F1组分经Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离后按照分子质量大小依次得到P1、P2、P3 3个组分，其中分子质量最小的P3组分抗氧化活性最高。P3组分经反相色谱分离所得4个组分中，最后被洗脱出来的P3-4组分疏水性最强且DPPH·自由基清除率最高，质量浓度为3 μg/mL的 P3-4溶液的DPPH·清除率为(58.8±0.78)%。通过LC-MS-MS 鉴定，抗氧化活性肽P3-4组分为十二肽，其氨基酸序列为Lys-Leu-Lys-Asp-Ser-Phe-Glu-Arg-Gln-Gly-Met-Val，分子质量为 1 437.8 u。本研究结果为深入开发紫苏蛋白资源，研发紫苏抗氧化活性肽提供理论参考。     

酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽的分离与稳定性研究

目的：研究酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽的分离和稳定性,为其开发应用提供基础数据。方法：超滤分离酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽,比色法测定其抗氧化能力。结果：超滤分级后得到分子质量为200～3 000 D的酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽对O2－•、•OH、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基的IC50分别为18.85 mg/mL、3.13 mg/mL、35.23 μg/mL。该抗氧化肽经过4 h胃蛋白酶+胰蛋白酶处理前后对DPPH自由基清除率分别为81.05%、82.26%;在pH 4、8条件下处理1 h,对DPPH自由基清除率分别为98.02%、11.80%（100 μg/mL）;在温度95 ℃条件下处理1 h,对DPPH自由基清除率为87.11%（100 μg/mL）;用浓度为1.0 mol/L的NaCl处理6 h,相比对照组,对DPPH自由基清除率由51.58%下降到22.68%（60 μg/mL）。结论：超滤后得到的分子质量为200～3 000 D的酶解缫丝蚕蛹蛋白抗氧化肽的抗氧化能力比酶解原液有一定提高;且在酸性、高温、脱盐处理后对DPPH自由基的清除能力保持较好;胃肠道消化酶对其DPPH自由基清除能力的影响不显著（P＞0.05）。     

蛋清抗氧化肽分离纯化及结构鉴定

为了获得高活性、高纯度的蛋清抗氧化肽,以蛋清酶解物为原料,依次釆用超滤、离子交换色谱、凝胶色谱分离纯化抗氧化活性较强的肽段,运用基质辅助激光解吸离子化质谱解析肽链的氨基酸序列。结果表明:超滤法分离纯化EWPH所得的三个组分中,EWPH-Ⅲ(M_W<3 kDa)组分的DPPH自由基清除率最高,达到79.62%。离子交换层析分离纯化EWPH-III所得到的碱性组分B的DPPH自由基清除率最高,达到82.05%。凝胶过滤色谱分离EWPH-III-B所得到4组分中E组分的DPPH自由基清除率最高,为88.49%。高活性高纯度EWPH-III-B-E组分的相对分子质量为237.575,该二肽的氨基酸序列为丙氨酸-甲硫氨酸。     

碱性蛋白酶Alcalase水解双低菜籽分离蛋白及产物抗氧化特性研究

以双低菜籽分离蛋白为原料,用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解,加酶量为18×104U/g,酶解时间为7h,酶解温度为50℃,酶解液的pH值8.0,底物浓度为3%时,其菜籽分离蛋白水解度达32.51%,氮收率达91.28%,并对产品蛋白活性肽的抗氧化特性进行了分析.     

虾头、虾壳抗氧化肽的分离纯化及其对秀丽隐杆线虫的抗氧化作用

采用超滤、凝胶过滤色谱和制备液相色谱对南美白对虾虾头、虾壳蛋白质的酶解液进行分离纯化,以1,1-二苯基-2-苦基肼自由基清除率、还原力、氧化自由基吸收能力为指标,制备纯度较高、抗氧化活性较强的抗氧化肽,同时,采用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）模型对其体内抗氧化活性进行评价。结果表明：酶解液经超滤分离后,分子质量为3～10?kDa组分的抗氧化活性最强;将该组分采用凝胶过滤色谱、制备液相色谱等手段分离出含有抗氧化肽的混合物（抗氧化肽纯度达到70%）。体内抗氧化活性结果显示,喂食该抗氧化肽的秀丽隐杆线虫的产卵量和热应激条件下的存活率均显著增长,寿命显著延长（P＜0.05）,且与VC相比效果无显著差异（P＞0.05）,说明本研究所获得的抗氧化肽对秀丽隐杆线虫具有和VC相当的抗氧化保护作用,具有潜在的应用价值。     

罗非鱼酶解肽抑制冷藏鱼糜中油脂和蛋白质氧化能力

将罗非鱼的酶解产物及其超滤组分（＜5 kD酶解肽）加入罗非鱼鱼糜制品中,研究其在冷藏（0～4 ℃）期间对油脂和蛋白质的抗氧化效果。结果表明：酶解产物及超滤组分均可以改善鱼糜的色泽（P＜0.05）,尤其是超滤组分的效果接近于一定剂量的VC;酶解产物对鱼糜中的油脂、蛋白质均表现出较强的抗氧化能力（P＜0.05）,其中超滤组分优于酶解液;酶解肽可以有效地保持鱼糜在冷藏期间的品质,超滤分离富集的＜5 kD的小分子肽显示出更好的抗氧化效果。     

猪皮胶原蛋白抗氧化肽的分离纯化及体外抗氧化活性研究

采用碱性蛋白酶对猪皮胶原蛋白进行酶解,制备抗氧化肽。为了得到抗氧化活性高且纯度高的抗氧化肽,本实验采用多种体外抗氧化评价体系研究超滤获得的各分子质量段猪皮胶原蛋白抗氧化肽的体外抗氧化活性;依次采用离子交换色谱、凝胶色谱对猪皮胶原蛋白酶解液进行分离纯化。结果显示:超滤分离获得5~10ku的抗氧化肽较其他分子量范围的抗氧化肽具有较好的抗氧化活性;采用离子交换色谱、凝胶色谱两种分离方法分步分离能达到较好的分离纯化效果,离子交换色谱分离得到7个组分,其中组分P1对O-2·清除率最高,多肽浓度为0.85mg/mL时,清除率为46.30%,IC50值为1.24mg/mL;该组分经过凝胶色谱分离后得到2个组分,其中组分P1-B对O-2·清除率最高,多肽浓度为0.9mg/mL时,清除率为49.43%,IC50值为0.98mg/mL。     

谷朊粉酶解物的制备及其ACE抑制肽的分离鉴定

以谷朊粉为原料,以血管紧张素转换酶（ACE）抑制率为指标,比较4种蛋白酶的酶解效果。采用超滤、葡聚糖凝胶色谱、反相高效液相色谱（RP-HPLC）的方法分离纯化ACE抑制肽并用电喷雾飞行时间质谱联用(ESI-TOF-MS)鉴定其结构。结果表明：碱性蛋白酶酶解3 h的谷朊粉酶解物具有较高的ACE抑制活性;超滤后,分子质量Mr<1 ku的组分具有较高的ACE抑制率;分离纯化后得到小肽的ACE抑制率高达（81.03±1.20）%;由ESI-TOF-MS质谱图得出该小肽的m/z为630.89,氨基酸序列为Trp-Phe-Gln-Pro（WFQP）。     

桑椹提取物中酚类化合物的抗氧化及抗糖基化活性分析

利用葡聚糖凝胶层析柱将桑椹提取物分为6 个组分（F1、F2、F3、F4、F5、F6）,研究了桑椹中酚类化合物的抗氧化能力和抗糖基化能力。采用Folin-酚法、pH示差法和高效液相色谱法测定各组分总酚、总花色苷含量和酚类化合物成分;通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、2,2’-联氮-二（3-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid),ABTS）自由基清除率和亚铁还原能力实验评价各组分抗氧化能力;建立牛血清白蛋白-果糖模拟反应体系和牛血清白蛋白-丙酮醛模拟反应体系评价各组分抗糖基化能力。结果表明：桑椹提取物中检测出5 种酚酸、两种花色苷和两种黄酮类物质;F3的总花色苷含量最高（P＜0.05,（101.10±2.39） mg 矢车菊素-3-葡萄糖苷当量/g）,F5的总酚含量最高（P＜0.05,（188.05±2.01） mg 没食子酸当量/g）;F3的抗氧化能力显著高于其他组分（P＜0.05,DPPH自由基清除能力、ABTS＋·清除能力、亚铁还原能力分别为（129.33±5.58）、（194.33±2.48）、（130.44±1.38） mmol Trolox/g）,F5的抗糖基化能力显著强于其他组分（P＜0.05,牛血清白蛋白-果糖模拟反应体系和牛血清白蛋白-丙酮醛模拟反应体系中的糖基化抑制率分别为（87.23±0.36）%和（66.99±1.62）%）;桑椹提取物的抗氧化能力、抗糖基化能力分别与总花色苷、总酚含量呈现显著的回归关系（P＜0.05）。     

抹茶品质的感官审评与成分分析

对6 种抹茶和3 种碾茶的品质进行感官评价,并采用常规成分测定法和自动氨基酸分析仪测定抹茶的氨基 酸组分,开展化学成分分析。结果表明：6 种抹茶粉的粒径约75～1.6 μm,达到超细微粉水平;具有抹茶的感官品 质特征,审评评分为（85.90±1.44）～（96.90±1.26）,香味阈值在1 500～2 500之间;抹茶内含物质总量和组成 丰富,水浸出物含量较高,均值为35.63%;抹茶滋味高鲜,游离氨基酸总量较高,均值为7.20%,其组分种类丰 富,多达18 种,组分含量达1 000 mg/kg以上的有茶氨酸、谷氨酸等7 种;抹茶色泽翠绿,试样叶绿素总量含量高, 均值为0.85%,且叶绿素a的含量较高,叶绿素a∶叶绿素b范围为（1.12±0.13）～（1.49±0.17）;产品质地细,粗 纤维含量较低,均值为8.70%。与日本抹茶产品相比,中国抹茶产品质量尚需提高,需要从茶园生态环境及其生产 的品种、栽培、采摘和制造等全过程进行深入研究,加强品控管理,进一步提高产品品质。     

响应面试验优化超声辅助提取连钱草多糖工艺及其体外抗氧化活性

通过中心复合试验优化超声辅助提取连钱草多糖的工艺,以1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基和2,2’-连氮基-双-（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）自由基（2,2’--azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical,ABTS＋•）清除能力、Fe2＋螯合力、铁离子还原抗氧化力（ferric reducingantioxidant power,FRAP）和N,N-二甲基-对苯二胺（N,N-dimethyl-p-phenylenediamine,DMPD）自由基清除能力为指标,研究连钱草多糖的体外抗氧化活性。结果表明,超声辅助提取连钱草多糖的最优工艺为pH 7.2、液固比32∶1（mL/g）、超声功率270 W、超声时间8 min,此条件下多糖提取率在4.95%～5.12%范围内。体外抗氧化活性结果显示,连钱草多糖DPPH自由基清除能力为（0.51±0.04）μmol Trolox/mg,ABTS＋•清除能力为（0.69±0.04）μmolTrolox/mg,Fe2＋螯合力为（0.51±0.29）μmol EDTA/mg,FRAP值为（3.45±0.03）μmol Trolox/mg,DMPD自由基清除能力为（0.17±0.01）μmol Trolox/mg。     

大鼠血浆中枸杞多糖荧光标记物定量分析方法的建立

建立大鼠血浆中异硫氰酸荧光素标记的枸杞多糖（fluorescein isothiocyanate labeled Lycium barbarum polysaccharides,LBP-FITC）的荧光定量分析方法,线性方程为y=1 378.7x－14.98（R2=0.998 9）,血浆中LBP-FITC质量浓度在0.05～10 μg/mL范围内与荧光强度呈良好的线性关系。方法的精密度、回收率以及稳定性考察分析证明该方法符合生物样品体内定量分析的要求。单次灌胃给予大鼠LBP-FITC后,以药代动力学WinNonlin软件采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据,计算主要的药代动力学参数为最大峰质量浓度（Cmax）（2.39±0.71） μg/mL、达峰时间（tmax）（1.17±0.41） h;药时曲线下面积AUC0-t为（45.85±7.12）（μg•h）/mL,AUC0-∞为（127.31±39.00）（μg•h）/mL;半衰期（t1/2）为（80.32±32.70） h;清除率为（1693.96±492.47）mL/kg;平均滞留时间为（20.64±1.36） h。     

野生桃金娘主要抗氧化成分及其抗氧化能力

本实验研究了野生桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）的抗氧化能力、总多酚含量、总黄酮含量、抗坏血酸含量和花青素类成分。采用超高效液相串联光电二极管阵列（photo-diode array,PDA）检测器和离子肼质谱法（ultra performance liquid chromatography coupled to photo-diode array and ion-trap mass spectrometry,UPLC-PDAIT-MS）鉴定花青素类化合物,通过高通量的自由基清除方法测定抗氧化能力。结果表明：野生桃金娘具有较高的抗氧化能力。每克桃金娘的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除能力相当于67.2 μmol的抗坏血酸和28.5 μmol没食子酸;过氧化氢自由基清除能力（PSC单位）相当于23.2 μmol的抗坏血酸和14.3 μmol没食子酸;2,2’-联氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid） ammonium salt,ABTS）自由基（ABTS+·）清除能力相当于30.4 μmol的抗坏血酸和7.8 μmol没食子酸;对三价铁的还原能力相当于28.7 μmol的抗坏血酸和3.1 μmol没食子酸。野生桃金娘的总多酚含量和总黄酮含量分别是4 976 mg 没食子酸/100 g（以干质量计）和49.7 mg儿茶酚/100 g（以干质量计）,总抗坏血酸含量是9 mg/100 g（以鲜质量计）。总花青素含量相当于414 mg矢车菊素/100 g（以干质量计）,共有飞燕草素3-O-葡萄糖苷等7 种花青素类化合物被鉴别出来。     

云南野生翅果藤营养活性成分分析

为研究翅果藤的食用价值,以成熟翅果藤果实为原料,测定其理化、营养活性成分、抗氧化能力。结果表明,翅果藤鲜果中水分含量为90.50%,蛋白质、可溶性蛋白含量分别为（11.29±0.228）、（7.19±0.129）mg/g,脂肪含量为（1.28±0.073）mg/g。翅果藤的矿物质含量略低于韭菜和西葫芦,但高于苹果的矿物质含量。翅果藤干粉的多糖含量高达（36.86±0.73）%,多酚和黄酮的含量分别为（30.52±0.86）、（8.34±0.24）mg/g。抗氧化活性中的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力为（362.24±17.89）mg/g（阿魏酸当量）,铁离子还原能力为（131.49±8.34）mmol/g,总抗氧化能力为（357.12±13.11）mg/g（VE当量）,还原能力为（1 066.67±24.23）μg/g（VC当量）。因此,翅果藤具有一定的营养价值和较高的抗氧化活性,开发和应用前景广阔。     

脱脂羊脑蛋白水解多肽的分离纯化及抗氧化活性

为制备羊脑蛋白抗氧化肽,本实验对脱脂羊脑蛋白含量及氨基酸组成进行了分析;采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）对枯草芽孢杆菌中性蛋白酶不同酶解时间的酶解液分子质量进行了分析;采用交联葡聚糖凝胶Sephadex G-25和Sephadex G-15对羊脑酶解产物进行了逐级分离纯化,以羟自由基（·OH）和亚硝酸根离子清除能力为指标对分离组分进行抗氧活性评价,并对纯化后的组分抗氧化活性进行了测定。结果表明,脱脂羊脑粉中蛋白含量为60.55%,在测定的17 种氨基酸中,谷氨酸和天冬氨酸这两种酸性氨基酸含量最高,且含有7 种必需氨基酸;羊脑蛋白经酶解后,分子质量集中在10 kD以下;经Sephadex G-25纯化后,得到了6 个组分,其中组分F4的抗氧化活性最强,组分F4经SephadexG-15纯化后,得到3 个组分,其中组分F4-2的抗氧化活性最强,组分F4-2对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基、·OH、超氧阴离子自由基（O2－·）、亚硝酸根离子的半数抑制率IC50分别为1.64、2.47、7.98、5.14 mg/mL。     

昆仑雪菊结合型黄酮类化合物的分离与鉴定

昆仑雪菊结合型黄酮类化合物因与细胞壁以共价键结合,难以直接用溶剂萃取出来。本研究采用碱降解法使结合型化合物释放出来并优化降解条件,在此基础上,利用不同溶剂对降解产物进行提取筛选出最佳的溶剂得到粗提物,利用常压硅胶柱层析和SepdexLH-20凝胶柱层析对粗提物中的黄酮类化合物进行分离纯化得到单体化合物,采用Fe3+还原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power,FRAP）法、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl,DPPH）法及2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-Azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）,ABTS）法对单体化合物进行抗氧化活性评价。结果表明：最佳的碱降解时间2 h、温度50 ℃、NaOH浓度2 mol/L,最佳提取溶剂为正丁醇;从粗提物中分离得到2 个单体化合物,采用核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）和电喷雾质谱（electrosprayionization mass spectra,ESIMS）鉴定其化学结构分别为金鸡菊查尔酮-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖（化合物1）、3’,4’,7,8-四羟基二氢黄酮（化合物2）;活性测定结果表明两个化合物的总抗氧化能力均强于阳性对照VE,化合物1与化合物2对DPPH自由基的半数抑制率IC50分别为（17.29±0.17）μmol/L和（70.09±0.09）μmol/L、对ABTS＋·半数抑制率IC50分别为（22.86±0.21）μmol/L和（33.4±0.18）μmol/L,远低于阳性对照VE的IC50值（分别为（78.08±1.63）μmol/L和（38.54±0.42）μmol/L）,说明两个化合物均有很强的抗氧化活性。     

蓝莓酒渣、果、酒中花色苷成分鉴定及酒渣与果中花色苷抗氧化活性比较

采用XAD-7HP大孔树脂对蓝莓果及蓝莓酒渣花色苷进行纯化,用固相微萃取小柱对蓝莓酒花色苷进行纯化浓缩。通过高效液相色谱-二极管阵列-电喷雾-串联质谱法鉴定了蓝莓果、酒渣、酒中花色苷的组成,并对蓝莓果和蓝莓酒渣花色苷的抗氧化性进行了评价。结果表明：通过XAD-7HP大孔树脂纯化所得的蓝莓果、蓝莓酒渣及利用固相微萃取小柱纯化所得的蓝莓酒中花色苷含量分别为（210.52±5.74）、（151.12±0.88）、（8.93±0.14）mg/g。蓝莓果中鉴定出11 种花色苷;蓝莓酒渣中鉴定出12 种花色苷,其中包括3 种酰化花色苷;蓝莓酒中鉴定出9 种花色苷,其中包含1 种酰化花色苷。蓝莓果和蓝莓酒渣花色苷抗氧化性实验结果表明,蓝莓果和蓝莓酒渣花色苷清除2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐自由基IC50值分别为（1.43±0.02）、（1.19±0.03）μg/mL,清除1,1-二苯基-2-苦基肼自由基IC50值分别为（3.28±0.03）、（2.41±0.01）μg/mL;蓝莓果和蓝莓酒渣花色苷清除自由基能力及还原力均显著优于VC,蓝莓酒渣花色苷抗氧化性显著强于蓝莓果花色苷。