副溶血性弧菌快速定量检测方法研究进展

副溶血性弧菌（VP）是我国沿海地区食物中毒最常见的病原菌之一,引发的食品安全事件逐年上升。目前定量检测食品中副溶血性弧菌的国家标准方法为最大可能数法,该方法检测时限长且操作步骤繁琐,不能满足快速定量检测的需求。随着现代生物技术的发展,新的定量检测方法不断涌现,研发了多种快速灵敏的副溶血性弧菌定量检测方法。本文综述了近年来生物技术领域常见的定量方法在副溶血性弧菌快速定量检测中的研究现状及应用进展,充分了解各检测方法的特点,以期为食品中副溶血性弧菌的快速精准定量检测研究提供理论参考及发展方向。     

上海市水产品副溶血性弧菌的污染情况及毒力基因分布

副溶血性弧菌是引起沿海城市食源性疾病爆发的主要致病菌之一。为了调查2015年7月—2016年6月上海市内水产品中副溶血性弧菌的污染情况及毒力菌株的分布,根据GB/T 4789. 2013《食品卫生微生物学检验副溶血性弧菌检验》方法结合聚合酶链式反应及环介导等温扩增技术,从206份水产样品中分离出201株疑似副溶血性弧菌,挑取疑似菌株接种至科玛嘉弧菌显色培养基并获取最大可能数,提取菌株基因组DNA对其进行毒力基因鉴定。从上海芦潮港码头收集71份样品中,有59份样品中分离出副溶血性弧菌,污染量为88.36 MPN/hg。上海市水产市场采样副溶血性弧菌污染率高达91.11%,污染量为1 361.76 MPN/hg。其中,tdh、trh阳性菌株污染率分别为1.6%、1.0%,均分离自虾中。研究表明,上海市售水产品中虾类是总副溶血性弧菌及致病性副溶血性弧菌污染率最高的水产品种类。水产品市场相对于自然环境而言具有更高的污染率和污染量,水产品捕捞后的一系列操作增加了副溶血性弧菌的污染。这些结果为上海市食源性疾病的防控提供了依据。     

金黄色葡萄球菌定量检测结果的不确定度评定

目的评定质控样品中金黄色葡萄球菌计数结果的不确定度。方法通过分析测量过程,确定并简化不确定度来源,运用统计学方法,分析不确定度分量、量化合成不确定度和扩展不确定度。结果金黄色葡萄球菌计数结果的不确定度来源较多,其中对不确定度贡献较大的为均质袋与样品稀释管及其稀释过程引入的不确定度、样品加样体积引入的不确定度、不同人员重复实验引入的不确定度。血浆凝固酶阳性实验,同样是构成偏差不可忽视的因素。金黄色葡萄球菌计数结果可表示为(10~(3.5778±0.095))CFU/g,k=2。结论该方法适用于质控样品中金黄色葡萄球菌计数结果的不确定度评定。     

恒温实时荧光法检测副溶血性弧菌

为了更加准确、快速地检测进出口食品中的副溶血性弧菌,针对副溶血性弧菌的tlh基因设计环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)引物,结合ESEQuant tube scanner来对扩增结果进行实时检测。结果显示:该引物扩增效率高、特异性强、灵敏度高(1-10 CFU/反应,约为荧光PCR的100倍)。126株副溶血性弧菌,恒温荧光法检测出126株,荧光PCR的方法检测出121株。恒温实时荧光检测仪与荧光PCR仪类似,均可以对检测结果进行实时监测和熔解曲线分析,表明该恒温实时荧光检测仪可广泛应用于基础实验室的科学研究或经济发展相对落后区域的临床初步诊断。     

瓦楞原纸定量测量不确定度的评定

按照测量不确定度评定的基本方法和程序对瓦楞原纸定量测量结果的不确定度进行了评定,不确定度来源主要是取样,其次为质量M的重复性测量和天平校准;瓦楞原纸定量测量结果的扩展不确定度是1g／m^2,包含因子为2;为提高定量测量准确度,应定期对定量标准试样取样器进行校准。     

能力验证样品中霉菌和酵母检测结果的不确定度评定

目的 评定能力验证样品中霉菌和酵母计数检测结果的不确定度。方法 根据能力验证作业指导书和GB4789.15-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》中第一法霉菌和酵母平板计数法对能力验证样品霉菌和酵母进行定量检测, 按照JJF1059.1-2012《测量不确定度的评定与表示》对检测结果进行不确定度评定。结果 在95%的置信区间下, 霉菌和酵母检测结果的扩展不确定度为0.0238。结论 本研究建立的评定方法可以对能力验证的样品霉菌和酵母定量检测进行不确定度评定, 且适用于检测条件相近的实验室进行相关的不确定度的评定。     

涤纶长丝断裂强度指标不确定度评定探讨

探讨试验中不确定度的分量来源,确立不确定度的模型,确定各分量评定方法,计算各分量标准不确定度,求出系数后进行不确定度合成,计算扩展不确定度后给出不确定度报告。本文以涤纶长丝物理性质中断裂强度为例,对其不确定度进行评定,得出主要影响不确定度的分量,提高数据分析的准确度。     

利用sQMRA软件开展广州市水产品副溶血性弧菌快速定量风险评估

目的 评估广州水产品副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)人群致病风险.方法 对2006—2018年广州市售鱼类、甲壳类、软体动物等水产品中的VP进行定量检测,利用广州市食物消费量调查、文献综述等方法,应用快速微生物定量风险评估软件(swift quantitative microbiol...     

食品中大肠菌群平板计数结果不确定度的评定

依据国家标准和测量不确定度的评定方法以及国际通行的普松理论(poisson theory),评定食品中大肠菌群检测结果的不确定度.通过分析影响食品中大肠菌群平板计数结果的不确定度来源,建立一种简单适用的大肠菌群平板计数不确定度评定方法.结果表明,影响食品中大肠菌群平板计数结果不确定度的主要因素为取样量的不确定度、稀释倍数的不确定度、加样体积的不确定度、平板上大肠菌群数量的不确定度和煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管产气比例产生的不确定度,其中后两者产生的不确定度所占分量最大.     

副溶血性弧菌K抗原检测实验条件优化

目的优化副溶血性弧菌K抗原检测的实验条件。方法通过调整菌悬液的浓度、选择基础实验材料和控制反应的温度3个方面的因素,对已知血清型的副溶血性弧菌进行血清学实验。结果当反应温度为37℃时,以90 mm无菌培养皿为基础耗材、20 mg/300μL浓度的菌悬液更容易快捷地观察到凝集现象,并且凝集颗粒较多,较大。结论基于本研究优化后的实验条件,使得凝集结果判读更加容易,实验操作更为简便、安全,且提高了血清学实验的效率。     

双重DPO-PCR检测副溶血弧菌和霍乱弧菌

根据副溶血弧菌collagenase基因和霍乱弧菌omp W基因,分别设计特异性DPO（dual priming oligonucleotide）引物,建立一种快速检测这两种弧菌的多重DPO-PCR方法,并对其特异性和灵敏度进行了评价。结果显示,设计的DPO引物特异性较强,副溶血弧菌和霍乱弧菌DNA可分别扩增出307 bp与463 bp的特异性条带,检测灵敏度均达0.1 ng/μL。该检测方法对退火温度不敏感。利用该方法对69株疑似弧菌菌株进行鉴定,结果与生理生化鉴定结果一致。该方法特异性强、灵敏度高,适合于对食品、水产品等中副溶血弧菌和霍乱弧菌的进行快速筛检。      

副溶血弧菌的磁珠捕获及检测

建立结合免疫磁珠和PCR快速检测副溶血性弧菌的新方法。本研究选用副溶血弧菌作为抗原免疫日本大耳兔制备了多克隆抗体,用ELISA法检测抗体效价。利用辛酸硫酸铵沉淀结合逆向吸附对多抗血清进行纯化,经SDS-PAGE和斑点杂交检测验证纯化后抗体的特异性。将纯化后的抗体偶联于羧基化修饰的纳米磁珠表面,用来进行菌体的捕获。结果表明,抗体的效价达到106,纯化获得只与副溶血弧菌发生反应的高纯度抗体。制备的免疫磁珠捕获率在55%～70%之间,且稳定性较好,盐离子浓度（3.5%NaCl、4.5%NaCl）对捕获率的影响不大,在pH5～9之间,磁珠捕获差异也较小。在对纯培养物的检测实验中,本方法最低检测限为102cfu/mL;而在鱼肉糜样本中的检测限为103cfu/mL,且样品中高浓度杂菌的存在不影响检测灵敏度。免疫磁珠结合PCR用于副溶血性弧菌的检测具有很高的灵敏度和特异性,具有广阔的前景。      

副溶血弧菌快速检测技术研究进展

副溶血弧菌是一种重要的嗜盐性食源性致病菌,广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼虾、贝类等海洋生物中。在我国沿海地区,由副溶血弧菌引起的食物中毒已成为微生物中毒的首要因素。本文分别以副溶血弧菌菌体、核酸、蛋白质和代谢产物为检测对象,介绍了各种PCR技术、酶联免疫吸附技术和生物传感器技术等目前副溶血弧菌的热点快速检测技术,对各种技术进行了比较分析,并对未来的发展前景作了展望。      

同时检测海产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌的合检方法评价研究

目的建立水产品中副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,并对合检方法对比进行评价。方法利用副溶血弧菌和霍乱弧菌阳性菌株,制备纯菌液、不同浓度梯度的人工污染样品。通过对30份纯菌液、30份人工污染样品和250份实际样品的检测,将建立的合检方法与行业标准(SN/T 1022-2010进出口食品中霍乱弧菌检验方法和SN/T 0173-2010进出口食品中副溶血性弧菌检验方法)进行比较,对合检方法进行效果评价。结果实验结果表明副溶血弧菌和霍乱弧菌合检方法,与行业标准检测结果完全一致。结论该方法可靠,对实验仪器和操作人员的要求低,具有良好的实用性,适合基础检测实验室。     

食品中副溶血性弧菌PCR快速检测方法的研究

为建立食品中副溶血性弧菌 (VP)的PCR检测方法 ,选取tl基因作为靶序列设计一对引物 ,用该引物对 14株从国内食品中分离的副溶血性弧菌 (经传统方法验证 )和 30株非副溶血性弧菌进行PCR扩增 ,并用此方法对人工污染食品进行检测。扩增片段表现出极好的特异性 ,对人工污染的冷冻虾仁、沙丁鱼的检出限为 10CFU g ,且与传统方法结果吻合。该方法适宜于食品中副溶血性弧菌的检测。     

LAMP技术快速检测海产品副溶血弧菌的条件优化

本研究以副溶血弧菌不耐热溶血素tlh为目标基因设计特异性引物,优化反应条件,并对特异性、灵敏度进行了验证。LAMP最佳反应条件为,外内引物浓度比为1∶8,Mg2+反应浓度为4 mmol/L,d NTPs浓度为3.5 mmol/L,温度为65℃,反应时长为1 h,只对副溶血弧菌产生扩增反应,与其余细菌不产生扩增反应,细菌基因组DNA和纯培养物的灵敏度约为5.45×101 fg/μL和140 cfu/m L,对人工污染食品样品进行检测,检出限为2.8×102 cfu/m L。该方法反应时间短、特异性强、灵敏度高。      

重组酶介导扩增技术快速检测水产品中副溶血性弧菌

目的 建立重组酶介导扩增技术(recombinase aid amplification,RAA)快速检测副溶血性弧菌的分析方法.方法 根据副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)tlh基因序列设计特异性引物,经引物筛选,建立副溶血性弧菌的RAA的快速检测方法.结果 该方法在30 min即可观察到...     

PMA-qPCR定量检测VBNC副溶血弧菌方法的建立与优化

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）在某些不利于生长的自然和食品加工条件下能够进入活的非可培养（viable but non-culturable, VBNC）状态,普通检测方式极易漏检,因此VBNC细菌检测技术的开发与优化对副溶血弧菌感染防控具有重要意义。基于叠氮溴化丙锭结合荧光定量PCR技术（propidium monoazide quantitative PCR,PMA-qPCR）能够利用活细胞的膜完整性区分活菌和死菌的原理,以副溶血弧菌ATCC 17802为对象,通过探讨PMA-qPCR方法中各项因素对活菌计数结果的影响,优化并建立了VBNC副溶血弧菌的定量检测方法。实验结果表明,当添加PMA质量浓度为15 mg/L,黑暗孵育10 min,再进行强光照射15 min后,死细胞的DNA扩增得到有效抑制,此时提取DNA模板进行qPCR扩增准确性更高,活菌数与qPCR扩增循环数呈现显著性线性相关（R²=0.99）。PMA-qPCR法测定副溶血弧菌活菌数的标准曲线显示该方法检测范围为2.90×10¹～2.90×10     

两种副溶血性弧菌检测方法的比对

目的比较国家标准中的定性检测法与快速检测法中的普通PCR法在检测食源性副溶血性弧菌上的区别与优劣,为今后针对副溶血性弧菌的检测方法的改进依据及应对突发食品安全事件时快速检测提供参考。方法采用GB4789.7-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验》与SN/T1869-2007《食品中多种致病菌快速检测方法 PCR法》对经阳性菌株污染的市售墨鱼干样品进行副溶血性弧菌的检测,并对2种方法进行对比。结果 2种方法在针对食源性副溶血性弧菌的检验上的比对结果均为检出。在实验耗时方面,国家标准法确认检出阳性需耗时4 d,快速检测法仅需耗时26 h。结论国家标准中的定性检测法与快速检测方法均能检出副溶血性弧菌,国标法在应对日常检验上标准且能够广泛应用,快速检测方法在快速、准确地应对食品安全突发事件方面具有优势。     

VITEK MS快速鉴定副溶血性弧菌的效果分析

目的评价VITEK MS对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)的识别能力。方法培养平板选用弧菌显色平板和血平板,处理方法选用甲酸辅助裂解法(方法1)和直接涂板法(方法2)。每个菌株的不同培养平板与处理方法的组合分别用RUO软件和IVD软件进行鉴定,鉴定结果用配对卡方检验分析培养平板和处理方法对鉴定结果的影响。用RUO软件对图谱做相似性分析。结果 IVD软件可以对139株VP的不同培养平板和方法组合100%鉴定到种的水平,RUO软件对方法1和方法2处理的属水平鉴定率分别不超过60%和45%,种水平的鉴定率分别不超过17%和9%,2种处理方法结果差异具有统计学意义(P0.05)。同一种处理方法2种平板的结果差异无统计学意义(P0.05)。VP图谱之间的相似性为45%～90%,其和溶藻弧菌图谱之间的相似性为54%～78%。结论 IVD软件对VP有较好的鉴定效果,RUO软件对其鉴定效果不理想,甲酸辅助裂解法可以稍微提高鉴定率。VP图谱和溶藻弧菌图谱有交叉聚类的现象。