水产品中志贺氏菌双抗夹心ELISA检测方法建立与应用

志贺氏菌(Shigella)通称痢疾杆菌,是一类具有传染性强和危害严重的革兰阴性食源性致病菌,广泛污染各类动物源性食品.该研究将志贺氏菌经0.5％福尔马林溶液灭活后,多次免疫雌性大耳兔获得抗志贺氏菌多克隆抗体,以抗志贺氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标...     

双抗夹心ELISA检测转Bar基因抗除草剂大豆

为快捷有效地检测转Bar基因抗除草剂大豆,利用已制备的抗除草剂Bar基因编码蛋白,膦丝菌素乙酰转移酶（phosphinothricin acetyltransferase,PAT）单克隆抗体和多克隆抗体,建立PAT蛋白双抗夹心酶联免疫吸附检测方法,对转Bar基因抗除草剂大豆不同组织材料进行定量检测。结果显示,最佳检测条件为捕获抗体质量浓度0.125 μg/mL,包被酶标板,37 ℃孵育1 h后4 ℃静置过夜,检测样品37 ℃孵育1.5 h,检测抗体质量浓度6.25 μg/mL,37 ℃孵育1.5 h;PAT蛋白的最低检测限为0.04 ng/mL,大豆蛋白体系中为8 ng/mL;重复性变异系数小于3%。利用上述检测条件,对实验建立的转Bar基因抗除草剂大豆进行PAT蛋白定量检测,成功地在根、茎、花、叶、种子不同部位检测到该蛋白的表达。     

牛初乳中sIgA双抗夹心ELISA检测方法的建立

为定量检测牛初乳中sIgA,建立双抗夹心ELISA方法。以牛初乳中的sIgA为抗原,免疫新西兰白兔,制得抗血清,经纯化后作为包被抗体;利用简易过碘酸钠法对兔抗牛sIgA标记辣根过氧化物酶(HRP),制得酶标抗体;通过方阵滴定法确定ELISA最佳工作条件;进行特异性、重复性、稳定性实验并且检测牛初乳粉样本中的sIgA含量。结果:成功建立了一种定量检测牛初乳中sIgA的双抗夹心ELISA方法。该方法线性范围:15.625～1 000μg/L;最低检测限(LOD)为15.625μg/L;精密度为:批内CV=4.8%;批间CV=6.5%。     

乳制品中牛IgG含量间接竞争性ELISA检测方法的研究

建立了牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品中牛IgG含量间接竞争性酶联免疫吸附测定方法,主要研究步骤包括:制备牛IgG保守区(Fc段),以Fc段为免疫原免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞进行细胞融合,制备特异性单克隆抗体及合成适合实际测定用途的ELISA试剂盒。应用本研究建立的方法对标准品和实际样品进行牛IgG含量检测的结果表明,该方法回收率在78.9%～117.5%,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,检测结果稳定可靠,可满足目前国内牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品品质监控的需要。      

乳制品中牛IgG含量间接竞争性ELISA检测方法的研究

建立了牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品中牛IgG含量间接竞争性酶联免疫吸附测定方法,主要研究步骤包括:制备牛IgG保守区(Fc段),以Fc段为免疫原免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞进行细胞融合,制备特异性单克隆抗体及合成适合实际测定用途的ELISA试剂盒。应用本研究建立的方法对标准品和实际样品进行牛IgG含量检测的结果表明,该方法回收率在78.9%～117.5%,批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,检测结果稳定可靠,可满足目前国内牛初乳制品和添加了牛初乳成分的乳制品品质监控的需要。     

金黄色葡萄球菌肠毒素P双抗夹心酶联免疫检测方法的建立

本研究目的是建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEP的双抗夹心酶联免疫方法。通过对单克隆抗体和抗血清质量浓度、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G(Ig G/HRP)最佳稀释度、不同种类包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、Ig G/HRP作用时间以及四甲基联苯胺(TMB)显色时间等条件进行优化;并采用灵敏度、批内和批间变异和加标回收率等对方法进行评价。结果表明:该方法中抗SEP单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为3.28μg/m L,抗SEI兔血清的质量浓度为3.14μg/m L,酶标二抗稀释度1:3000,1×磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)为最佳包被缓冲液,封闭时间为1 h,抗原孵育时间为90 min,酶标二抗反应时间为30 min,TMB显色时间15 min。该方法回归方程为y=0.0313x+0.0262,R2=0.9946。灵敏度为1.80μg/m L,精密度批内变异低于6%,批间变异低于15%,对LB肉汤、牛肉糜和熟米饭回收率达90%以上。     

双抗夹心酶联免疫吸附法检测沙门氏菌

沙门氏菌是自然界中普遍存在的一种食源性致病菌,在中国的食物中毒中沙门氏菌引起的病例占第一位。本研究以福尔马林灭活的鼠伤寒沙门氏菌免疫雌性日本大耳兔,制备抗沙门氏菌多克隆抗体。以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体,以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体,建立快速检测沙门氏菌双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法可以检测A、B、C、D、E等五种典型的沙门氏菌,对沙门氏菌纯培养液的最低检测量为1×104CFU/mL,与其他杂菌不存在交叉反应,具有较好的灵敏性和特异性。      

花生致敏蛋白Ara h1双抗体夹心ELISA法的建立

为建立用于花生致敏蛋白Ara h 1快速、灵敏、特异检测的双抗体夹心ELISA法,以Ara h 1鼠源单抗(mAb)为捕获抗体,以Ara h 1兔源多抗(pAb)为检测抗体,通过棋盘法优化抗体工作浓度建立方法,并对方法的灵敏度、特异性、准确度、稳定性等检测特性进行鉴定。结果表明,双抗体夹心ELISA法的mAb和pAb最佳工作浓度分别为1∶10 000稀释和1∶8 000稀释;ELISA标准曲线线性范围为4～256ng/mL,检测限为4.16ng/mL;样品添加回收试验的平均回收率为85.9%～94.5%,且该方法与其他常见致敏蛋白无交叉反应;并能在4℃条件下避光密封保存90d内保持检测结果稳定。说明所建立的双抗体夹心ELISA法灵敏特异、准确稳定,能够用于花生致敏蛋白Ara h 1的快速筛查。     

金黄色葡萄球菌新型肠毒素I双抗夹心-酶联免疫检测方法的建立

目的：建立简便、灵敏检测金黄色葡萄球菌肠毒素I（staphylococcal enterotoxin I,SEI）的双抗夹心酶联免疫吸附方法（double-antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay,DAS-ELISA）。方法：利用DAS-ELISA检测程序确定单克隆抗体、抗血清、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记的羊抗兔IgG（IgG/HRP）的最佳稀释度,再通过检测不同包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、IgG/HRP作用时间以及四甲基联苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine,TMB）显色时间条件下的OD450 nm值对实验条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标回收率指标对方法进行评价。结果：抗SEI单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为2.89 mg/L,抗SEI兔血清稀释度1∶2 000,酶标二抗稀释度1∶6 000;1×磷酸缓冲盐溶液（pH 7.4）为最佳包被缓冲液;最佳封闭时间、抗原孵育时间、酶标二抗孵育时间和TMB显色时间分别为60、90、30 min和15 min。该方法的回归方程为y=0.040 9x＋0.042 9,R2=0.993 3;灵敏度为0.5 μg/L,精密度批内变异低于10%,批间变异低于15%,除巴氏杀菌牛乳外,对生理盐水、熟牦牛肉糜、大米饭和超高温瞬时灭菌牛乳回收率达90%以上。结论：本研究建立了一种快速检测SEI的双抗夹心方法。     

标准NY/T2070-2011牛初乳中免疫球蛋白G测定不确定度研究

对牛初乳粉中免疫球蛋白IgG的测定过程进行分析,建立数学模型。评定各不确定度分量,合成标准不确定度,计算测定结果的扩展不确定度。结果表明:主要来源于标准曲线的拟合,样品的均匀性和样品前处理过程的一致性。当置信概率为95%,采用该方法测定试样中IgG的扩展不确定度为3.4,则试样中IgG的测量结果可表示为(28.3±3.4)%。     

双抗夹心酶联免疫吸附快速检测冷鲜肉中的6 种血清型沙门氏菌

为快速检测冷鲜肉中的沙门氏菌,筛选出1 株产抗6 种沙门氏菌单克隆抗体的细胞株,运用产生的抗体建立酶联免疫吸附检测方法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。实验采用6 种血清型致病沙门氏菌制备出混合抗原,对BALB/c小鼠及新西兰大白兔进行免疫,运用杂交瘤技术进行细胞融合,制备出抗沙门氏菌单克隆抗体以及多克隆抗体,并建立双抗夹心ELISA体系检测冷鲜肉中沙门氏菌。结果表明,成功筛选出1 株能稳定分泌抗沙门氏菌的单克隆抗体杂交瘤细胞株6E7,保藏编号为CGMCC 10313以及多克隆抗体,效价分别为1∶1.28×106和1∶8.0×105 ;将多抗作为包被抗体吸附于96 孔酶标板上,并用辣根过氧化物酶标记单抗,建立双抗夹心ELISA体系;检测模拟污染肉样中沙门氏菌,其检测限为800 CFU/g;并与其他血清型沙门氏菌、志贺氏菌、阪崎肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌均无交叉反应,特异性良好。     

抗牛免疫球蛋白G单克隆抗体的制备及鉴定

采用杂交瘤技术从90株融合株中筛选得到分泌抗牛免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）单克隆抗体的2F6、5E3、9C6、9H8四个细胞株。其抗体亚型均为IgG1型,腹水单克隆抗体的效价可达5.12×106;5E3、9H8识别牛IgG重链Fc片段,2F6识别牛IgG轻链Fab片段,9C6识别牛IgG重链Fab片段;9C6与牛IgG1和牛IgG2反应,与山羊IgG、绵羊IgG、兔IgG、牛IgM、牛乳酪蛋白、牛乳β-乳球蛋白、牛乳铁蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵清白蛋白、鱼明胶的交叉反应率均小于1%;9C6亲合力常数达牛乳8.92×108?L/mol。     

双抗夹心ELISA方法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌

采用0.5% 福尔马林灭活的单核细胞增生李斯特氏菌作为免疫原免疫日本大耳兔,获得抗单核细胞增生李斯特氏菌多克隆抗体,并以此多克隆抗体作为捕获抗体,以抗单核细胞增生李斯特氏菌Internalin A(InlA)单克隆抗体作为检测抗体,建立快速、特异的检测该菌的双抗夹心ELISA 方法。结果表明：该方法对单核细胞增生李斯特氏菌纯培养液的最低检测量为1.7 × 105CFU/mL。在检测食品样品的实验中,食品样本对本方法干扰较小,运用选择性增菌液进行前增菌可提高该方法的准确性。     

抗副溶血弧菌OMPK单克隆抗体的制备及其ELISA双抗体夹心检测方法建立

制备全长和截短的弧菌外膜蛋白K（outer membrane protein K,OMPK）,纯化后的OMPK免疫6～8 周雌性BALB/c小鼠,间接夹心酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测小鼠的血清效价,结果表明全长OMPK重组蛋白制备的血清效价是截短OMPK1重组蛋白制备血清效价的128 倍。通过全长的OMPK重组蛋白制备多株用于检测副溶血弧菌的单克隆抗体,用生物素（biotin）和辣根过氧化物酶对单克隆抗体进行标记。间接夹心ELISA实验结果表明：只有VP3-biotin和VP16-biotin与其他单克隆抗体配对检测不同的副溶血弧菌菌株表现出较高的灵敏度及良好的特异性,并且在检测其他种属20 株菌时无交叉反应。VP16(Fab)-biotin/VP3检测副溶血弧菌时较VP16-biotin/VP3具有更高的灵敏度,该方法用于检测海鲜样品时,VP16-biotin/VP3检测三文鱼（5～10 CFU/25 g）和血蚶样品为副溶血弧菌阳性。本研究开发了一种快速、灵敏、简便的副溶血弧菌间接夹心ELISA检测方法。     

高静水压处理对牛初乳中IgG的影响

采取不同的高静水压条件（处理压强、施压温度、保压时间）处理产犊后48 h内的牛初乳,研究高静水压处理牛初乳对免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）活性的影响。将牛初乳离心去除酪蛋白、乳脂肪等,取上清液进行高静水压处理,采用高效液相色谱法和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamidegel electrophoresis,SDS-PAGE）对处理后的样品进行检测。结果表明：高静水压处理后的样品,经高效液相色谱仪检测,其与亲和色谱柱发生特异性吸附的能力下降,IgG检出质量浓度降低;经SDS-PAGE检测和凝胶电泳成像仪扫描处理,不同处理条件下IgG的轻链和重链的质量变化不显著。因此,当牛初乳在200 MPa、30 ℃和20 min的高静水压处理条件下,IgG的活性最好,检出质量浓度为16.843 9 mg/mL。     

超滤法浓缩分离免疫初乳中的抗体

收集经大肠杆菌、沙门氏菌混合疫苗免疫处理的乳牛产后７天之内初乳,经去脂、去酪蛋白后所得免疫初乳乳清,用中空纤维超滤器（分子截留为１００ｋｕ（１００ｋｄ）进行浓缩分离,浓缩４．５～７倍、ＩｇＧ收率在９０％以上。为了制得高纯度ＩｇＧ分离物,可和３５％饱和度的硫胺进行盐析,然后再进行超滤脱盐、浓缩、制得的ＩｇＧ浓缩物纯度达８０％以上,这一工艺适合工业化生产。     

牛初乳中主要生物活性物质开发的最新进展

综述了近年来牛初乳资源的开发利用状况 ,重点介绍了几种主要功能性物质如免疫球蛋白 (IgG) ,乳铁蛋白 (Lf)及类胰岛素生长因子 (IGF)的分离纯化技术 ,并对牛初乳的综合利用前景进行展望     

免疫透射比浊法测定初乳制品中IgG的质量浓度

应用免疫透射比浊法测定牛初乳中IgG的质量浓度,质量浓度在0.07～0.75g/L范围内线性关系良好。该方法准确性好,回收率较高,与火箭免疫电泳法比较,测定结果差异不显著,这说明该方法具有良好的可靠性。