轮状病毒核酸标准物质研究

目的:研制用于食品中轮状病毒聚合酶链式反应检测的核酸标准物质。方法:从RV阳性粪便样品中提取RNA后,利用基因克隆体外转录方法制备RV cRNA纯品,均匀性初检后,稀释至10-4后分装,制备RV核酸标准物质样品。cRNA经核酸测序确定同源性后,采用微滴式数字PCR方法进行均匀性和稳定性研究。RV核酸标准物质的标准值由多家实验室应用ddPCR联合定值获得,并进行不确定度分析。结果:均匀性结果显示RV核酸标准物质组间精密度与组内精密度差异均无统计学意义(P0.05)。稳定性检验表明室温(20~25℃)3 d,4℃7 d,-20℃21 d及-80℃6个月样品cRNA含量无显著变化。定值研究和不确定度评价得RV核酸标准物质的标准值为6.60×10~7拷贝/μL,其扩展不确定度为0.60×10~7拷贝/μL。结论:RV核酸标准物质均匀性和稳定性符合二级标准物质技术规范,可作为RV PCR检测的标准物质。     

含4 种食源性病毒检测靶标多联装甲RNA的制备、纯化与定值

基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台构建同时含有诺如病毒（norovirus,NoV）、甲肝病毒（hepatitis A virus,HAV）、轮状病毒（rotavirus,RV）、星状病毒（astrovirus,AstV）检测靶标RNA的多联装甲RNA（multiplex armored RNA,AR-MulV）,并进行纯化与初步定值。结果表明,重组质粒在大肠杆菌中成功表达,表达产物大小约为14.1 kDa;制备的AR-MulV经纯化后无杂蛋白与残留重组质粒,电镜下可见大量结构形态完整的病毒样颗粒,大小约为25 nm。初步定值结果显示,AR-MulV中GI型NoV、GII型NoV、HAV、RV和AstV检测靶标RNA的含量分别为（1.24±0.2）×107、（2.54±0.6）×107、（2.24±0.3）×107、（2.96±0.5）×107 copies/μL和（3.19±0.4）×107 copies/μL。本研究基于Qβ噬菌体装甲RNA制备平台成功制备同时包含4 种食源性病毒标准方法检测靶标的多联装甲RNA,为食源性病毒的分子检测以及多重实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应阳性质控样品的研发提供新思路。     

实时荧光定量PCR技术监测腌制麻竹笋中乳酸乳球菌动态变化

采用实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）技术定量监测6 g/100 mL盐质量浓度腌制麻竹笋中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的动态变化。经乳酸乳球菌标准菌株基因组DNA提取、标准阳性质粒制备、标准曲线绘制、各时期竹笋腌制发酵液中细菌基因组DNA提取和乳酸乳球菌qRTPCR特异性扩增,对腌制液中乳酸乳球菌进行定量检测。结果表明,在腌制过程中（0～63 d）,随着腌制时间的延长,乳酸乳球菌含量逐渐升高,在腌制14 d时达到最大值（4.63×108 copies/μL）,与0 d（2.41×102 copies/μL）相比增加了6 个数量级,而后浓度缓慢降低,在腌制63 d时浓度为5.02×106 copies/μL。qRT-PCR技术为定量监测腌制麻竹笋中微生物的动态变化提供了一条可靠、快速的有效途径。     

辣椒油中苯并芘参考标准物质的制备与定值

为建立辣椒油中苯并芘标准物质的研制和定值方法,向辣椒油中添加一定量的苯并芘标准溶液,搅拌均匀后分装100 瓶,随机抽取10 瓶样品进行样品均匀性检验,在95% 置信区间内,检验结果同时通过F 检验和t 检验。在恒温4℃冷藏和常温20℃条件下,在8 周内进行样品的稳定性检验,检验结果通过t 检验,在95% 置信区间内。并通过分析标准物质制备过程中的不确定度来源,计算出不确定度分量、合成标准不确定度及扩展不确定度。制备的辣椒油中苯并芘采用同位素稀释气相色谱- 质谱联用法进行辣椒油中苯并芘定值,定值后的辣椒油样品中苯并芘含量为(9.98 ± 0.914)μg/kg(k ＝ 2)。本标准物质对于植物油中苯并芘检测的方法验证和质量控制具有重要意义。     

蒜氨酸标准物质的定值研究

建立蒜氨酸标准物质的定值方法。鲜蒜经一系列提取、分离、纯化得蒜氨酸标准物质。应用高效液相色谱面积归一法确定蒜氨酸标准物质的纯度。随机抽取10 瓶样品进行均匀性检验,经F检验,样品均匀性良好。长期稳定性结果经t检验表明在4 ℃条件下蒜氨酸的稳定期不少于43 个月。采取9 个实验室协作定值的方法对样品进行检测定值,定值结果由标准值和不确定度表示为（99.49±0.95）%。研制的蒜氨酸标准物质通过了国家标准委的审评,并已应用于实际检测中。     

GI/GII型诺如病毒两联装甲RNA标准样品的研制

针对目前缺乏适配多项检测标准、稳定、安全的诺如病毒RNA标准样品的问题,研制基于MS2噬菌体内含常见GI/GII型诺如病毒检测靶标两联装甲RNA标准参考样品。人工合成MS2噬菌体成熟酶基因、衣壳蛋白基因、包装位点及GI/GII型诺如病毒靶标基因,克隆于表达载体pET-28a(+)中,构建重组质粒pET-MS2-NoV。经大肠杆菌BL21诱导表达,先后利用PEG6000、酶处理和丙烯葡聚糖凝胶层析柱纯化表达产物。SDS-PAGE和透射电镜鉴定产物大小及结构,荧光定量PCR检测有无残留核酸。之后对纯化的病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）开展定值、均匀性和短期稳定性研究。SDS-PAGE结果表明重组质粒在BL21中表达出了目的蛋白,大小在10~15 ku之间,与预期一致;纯化后的VLPs无杂蛋白和残留核酸;透射电镜下呈结构完整、大小均一的球状,直径约25 nm。纯化后AR-NoV中GI型和GII型靶标定值结果分别为(4.04±0.62)×107 copies/μL和(6.16±0.30)×107 copies/μL。单因素方差检验证实样品均一性良好,F相似文献   

大鼠血浆中枸杞多糖荧光标记物定量分析方法的建立

建立大鼠血浆中异硫氰酸荧光素标记的枸杞多糖（fluorescein isothiocyanate labeled Lycium barbarum polysaccharides,LBP-FITC）的荧光定量分析方法,线性方程为y=1 378.7x－14.98（R2=0.998 9）,血浆中LBP-FITC质量浓度在0.05～10 μg/mL范围内与荧光强度呈良好的线性关系。方法的精密度、回收率以及稳定性考察分析证明该方法符合生物样品体内定量分析的要求。单次灌胃给予大鼠LBP-FITC后,以药代动力学WinNonlin软件采用非房室模型拟合大鼠单次口服LBP-FITC的经时血药质量浓度数据,计算主要的药代动力学参数为最大峰质量浓度（Cmax）（2.39±0.71） μg/mL、达峰时间（tmax）（1.17±0.41） h;药时曲线下面积AUC0-t为（45.85±7.12）（μg•h）/mL,AUC0-∞为（127.31±39.00）（μg•h）/mL;半衰期（t1/2）为（80.32±32.70） h;清除率为（1693.96±492.47）mL/kg;平均滞留时间为（20.64±1.36） h。     

角鲨烯国家标准样品的研制

为研制角鲨烯国家标准样品。以角鲨烯粗品为原料,制备高纯角鲨烯,采用红外光谱、高分辨质谱和核磁共振谱进行结构确证。样品分装成150 瓶后,采用气相色谱-氢火焰离子化检测器法进行均匀性、稳定性检验和定值分析。从样品中随机抽取15 瓶进行均匀性检验,经F检验表明在95%置信区间范围内样品均匀性良好;稳定性考察按照－18 ℃长期实验稳定性（24 个月）进行,结果表明在考察期间内样品稳定性良好;标准样品经国内8 家具有分析资质的实验室进行协同定值,并评定了定值结果的不确定度,角鲨烯标准样品定值结果为99.57%,相对扩展不确定度为0.30%（k=1.96）。该标准样品达到国家标准样品的技术要求,可用于有关角鲨烯的方法校正和质量控制。     

猪背最长肌PFK-2/FBPase-2荧光定量RT-PCR方法的建立

为研究糖酵解关键酶果糖-6-磷酸-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-
bisphosphatase,PFK-2/FBPase-2）基因转录水平与宰后肉品质间的关系,根据猪PFK-2/FBPase-2 mRNA序列
（GenBank登录号：NM_001143721.1）设计一对特异性引物并选择β-actin作为内参基因,构建含有各自序列的重组
质粒标准品,通过对反应条件的优化,建立了荧光定量实时-聚合酶链式反应技术检测猪PFK-2/FBPase-2基因转录
水平的方法。结果表明,所建立的方法线性关系好,目的基因与内参基因R2均大于0.999;灵敏度高,两基因检出
下限均为10 拷贝/μL;特异性好,扩增产物均有特异性单一峰。同时根据标准曲线计算可知目的基因与内参基因的
扩增效率分别为104.5%和104.0%,扩增效率接近一致,可对PFK-2/FBPase-2转录水平进行相对定量。本研究选取
PSE肉产生程度不同的三元杂交猪、杜洛克猪和太湖猪,利用建立的方法对不同品种猪宰后45 min背最长肌中PFK-
2/FBPase-2 mRNA转录水平进行测定,结果表明,太湖猪转录水平最高、杜洛克次之、三元杂交猪最低,且3 个品
种间有显著性差异（P＜0.05）。     

基于内参的大肠埃希氏菌O157∶H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

针对大肠埃希氏菌O157∶H7 rfbE和Flic靶基因保守序列,设计特异性引物和探针,优化反应体系,并加入内参（internal amplification control,IAC）,建立能够实时监控反应过程的荧光定量聚合酶链式反应（polymeasechain reaction,PCR）检测方法。结果表明,该方法对E. coli O157∶H7基因组DNA的最低检测限为1 pg/μL;对含有靶基因质粒的最低检测限为103 copies/μL;对细菌的最低检测限为5×103 CFM/mL;Ct值与模板拷贝数均呈良好的线性关系（R2=0.999）。人工污染实验结果表明,在初始菌量为7 CFM/25 g时,采用水洗加试剂盒法提取DNA,E. coli O157∶H7在增菌6 h后即可检出;而采用水煮法提取DNA,则在增菌10 h后方可检出。建立的E. coli O157∶H7实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中O157∶H7,又能实时监测PCR反应过程,有效防止“假阴性”的发生。     

实时荧光聚合酶链式反应技术快速鉴定仿刺参

基于仿刺参线粒体COX1基因、NAD4基因分别设计特异性检测引物和探针,采用TaqMan探针实时荧光聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术进行仿刺参的特异性鉴定检测。对21 种海参样品进行实时荧光PCR检测的特异性检验,并对每个样品做3 个平行实验,计算Ct平均值、标准偏差及变异系数,评估检测方法的重复性。结果表明：所设计的引物和探针可以特异性的鉴别仿刺参,方法的变异系数均小于2%,表明本研究设计的引物和探针具有良好的重复性。本研究所建立的快速检测仿刺参的方法快速、简便,既克服了传统海参鉴别方法的局限性,同时又结合了荧光PCR技术高效率、低污染的优点,为仿刺参真伪鉴别研究提供了有价值的参考意见。     

老黑谷米色素的提取工艺优化及体外抗氧化活性分析

以老黑谷米为对象,在单因素试验的基础上,利用二次通用旋转试验设计,对老黑谷米色素的提取工艺进行了优化,并对色素的体外抗氧化活性进行了评价。结果表明:老黑谷米色素的最佳提取溶剂为乙醇,在282 nm和342 nm处有最大吸收波长,初步定性为黄酮醇类物质;该色素的最佳提取条件为提取温度30℃、液料比20∶1(m L/g)、提取时间40 min;该色素具有较好的抗氧化活性,DPPH自由基清除能力为(3 512.56±26.28)μg阿魏酸/g,铁离子还原/抗氧化能力为(44.04±6.60)mmol Fe~(2+)/L,还原能力为(203.47±23.75)μg抗坏血酸/g,H_2O_2清除活性为(3 676.60±114.32)μg阿魏酸/g,ABTS~+·清除能力为(2 778.70±262.90)μg Trolox/g。     

HPLC-DAD结合交替三线性分解二阶校正法测定荔枝果肉中游离植物甾醇

为快速测定荔枝果肉中游离植物甾醇含量,建立高效液相色谱-二极管阵列检测器结合基于交替三线性分解算法的二阶校正方法。基本色谱条件：岛津ODS-SP柱（150 mm×4.6 mm,5 μm）,流动相体积分数95%乙腈溶液,检测波长范围为190～340 nm,柱温30 ℃,流速1.0 mL/min,进样量20.0 μL。结果表明,‘兰竹’和‘乌叶’荔枝样品中菜油甾醇含量分别为24.1 μg/g和27.4 μg/g,两种荔枝样品豆甾醇含量分别为25.8 μg/g和26.7 μg/g,菜油甾醇和豆甾醇加标回收率分别为（95.25±0.78）%和（96.83±1.01）%。所建立的方法简单、准确、灵敏度高且可靠,可用于检测荔枝果肉中游离植物甾醇含量。     

响应面法优化豆乳链球菌增殖培养基

针对优良酸豆乳发酵菌株豆乳链球菌（Streptococcus sojalactis）SY1.1增殖培养基进行优化,研究碳氮源对豆乳链球菌生长的影响,并采用响应面法优化豆乳链球菌SY1.1的增殖培养基配方。结果表明：以AST为基础培养基,优选大豆蛋白胨和蔗糖为最适氮源和碳源,质量比为1∶2,采用Plackett-Burman设计对11 种促乳酸菌生长因子进行评价,利用中心旋转组合设计和响应面分析确定增殖培养基的配方为：蔗糖10 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、番茄汁85.8 mL/L、胡萝卜汁109 mL/L、玉米浆6 g/L,pH 6.8。SY1.1以接种量2%,在37 ℃培养12 h时,活菌数可达（8.9±0.2）×108 CFU/mL,较初始豆浆培养基的活菌数（1.03×108 CFU/mL）提高了7.64 倍。     

益生菌切达干酪成熟过程中细菌群落的多样性分析

采用选择性培养基和聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gelelectrophoresis,PCR-DGGE）技术,研究益生菌切达干酪成熟过程中（6 ℃,180 d）细菌群落构成及益生菌（干酪乳杆菌LC2W）的存活情况。结果表明：SBM和MSE等选择性培养基存在选择专一性不强的缺点,不能客观反映干酪内各种微生物的动态变化;随着切达干酪成熟时间的增加,发酵剂嗜热链球菌和乳酸乳球菌的数量明显下降,而非发酵剂菌群乳杆菌的数量和主要种类呈上升趋势;干酪成熟180 d后,干酪乳杆菌LC2W的存活量仍高于1×108CFU/g。切达干酪能作为干酪乳杆菌LC2W存活的良好载体;PCR-DGGE技术和选择计数法联用更加适合干酪细菌群落结构的分析。     

肠炎沙门氏菌EMA-PCR检测方法的建立

将荧光染料叠氮溴化乙锭（ethidium monoazide,EMA）与聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）检测技术相结合,用于肠炎沙门氏菌活菌的检测。实验参数优化结果表明,当EMA终质量浓度50 μg/mL、曝光时间10 min时,可以抑制约107 CFU/mL肠炎沙门氏菌死菌DNA的扩增;活菌灵敏度检测结果显示,EMA-PCR方法检测限与单一PCR方法一样均为27.5 CFU/mL,说明EMA处理既不会影响活菌DNA的扩增也不会影响PCR方法的灵敏度。利用EMA-PCR方法检测死活混合菌液时发现,添加EMA的实验组DNA条带亮度会随着活菌比例的降低而变暗,且当样品中全是死菌时,没有目标条带出现;而不添加EMA的对照组DNA条带亮度没有变化,当样品中全是死菌时,目标条带依然清晰可见。说明添加EMA可以达到区分死活菌的目的,EMA-PCR方法只检测样品中的活菌,避免了死菌DNA造成假阳性的可能性。     

甘草多糖对单核细胞增生性李斯特菌体内外生长的影响

目的：探讨甘草多糖对单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes,Lm）体内外生长的影响。方法：采用平板计数法和荧光显微镜、分光光度法及Bliss法分别分析甘草多糖对Lm生长速率和生物被膜形成的影响及计算细菌对小鼠半数致死量（median lethal dose,LD50）。观察低剂量（1 mg/kg）、中剂量（10 mg/kg）和高剂量（100 mg/kg）甘草多糖对感染100×LD50 Lm小鼠的保护力。小鼠感染0.01×LD50的Lm后1、7、14、21、28、35 d剖杀小鼠,检测脾脏、肝脏和肺脏中Lm分布的消长情况。结果：低质量浓度时（10、20、50 μg/mL）,甘草多糖随着质量浓度增加对Lm标准菌株10403S生长速率和生物被膜形成的促进作用呈上升趋势;但高质量浓度时（100、200 μg/mL）这种促进作用逐渐降低。Lm口服感染小鼠的LD50为2.70×108 CFU。高剂量甘草多糖对于100×LD50的Lm感染可提供50%的保护力。0.01×LD50的Lm感染小鼠,随着甘草多糖质量浓度增加小鼠脾脏、肝脏和肺脏的细菌量逐渐减少。结论：低质量浓度甘草多糖在体外对Lm的生长具有促进作用,但随着质量浓度增高促进强度逐渐降低,而甘草多糖可以提高小鼠抵抗Lm感染的能力。