金黄色葡萄球菌肠毒素P双抗夹心酶联免疫检测方法的建立

本研究目的是建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEP的双抗夹心酶联免疫方法。通过对单克隆抗体和抗血清质量浓度、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G(Ig G/HRP)最佳稀释度、不同种类包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、Ig G/HRP作用时间以及四甲基联苯胺(TMB)显色时间等条件进行优化;并采用灵敏度、批内和批间变异和加标回收率等对方法进行评价。结果表明:该方法中抗SEP单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为3.28μg/m L,抗SEI兔血清的质量浓度为3.14μg/m L,酶标二抗稀释度1:3000,1×磷酸缓冲盐溶液(pH 7.4)为最佳包被缓冲液,封闭时间为1 h,抗原孵育时间为90 min,酶标二抗反应时间为30 min,TMB显色时间15 min。该方法回归方程为y=0.0313x+0.0262,R2=0.9946。灵敏度为1.80μg/m L,精密度批内变异低于6%,批间变异低于15%,对LB肉汤、牛肉糜和熟米饭回收率达90%以上。     

金黄色葡萄球菌肠毒素P双抗夹心酶联免疫检测方法研究

本研究目的是建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素 SEP 的双抗夹心酶联免疫方法。通过对单克隆抗体和抗血清质量浓度、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 Ig G（Ig G/HRP）最佳稀释度、不同种类包被缓冲液、封闭时间、抗原包被时间、Ig G/HRP作用时间以及四甲基联苯胺（TMB）显色时间等条件进行优化;并采用灵敏度、批内和批间变异和加标回收率等对方法进行评价。结果表明：该方法中抗 SEP 单克隆抗体的最佳稀释质量浓度为 3.28 μg/m L,抗 SEI 兔血清的质量浓度为 3.14 μg/m L,酶标二抗稀释度 1:3000,1×磷酸缓冲盐溶液（p H 7.4）为最佳包被缓冲液,封闭时间为 1 h,抗原孵育时间为 90 min,酶标二抗反应时间为 30 min,TMB 显色时间 15 min。该方法回归方程为 y=0.0313x+0.0262,R2=0.9946。灵敏度为 1.80 μg/m L,精密度批内变异低于 6%,批间变异低于 15%,对 LB 肉汤、牛肉糜和熟米饭回收率达 90%以上。     

竞争抑制酶联免疫吸附法快速检测金黄色葡萄球菌肠毒素P

目的 建立一种稳定性强、灵敏度高的快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素P(staphylococcal enterotoxin P,SEP)的单克隆抗体竞争抑制酶联免疫吸附法(Enzyme-linked Immunosorbent assay,ELISA)。方法 根据ELISA的检测程序,利用交叉方阵滴定法确定SEP抗原的最佳包被浓度及单克隆抗体的最佳倍比稀释浓度,再对辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP-IgG)最佳稀释浓度及最佳反应时间进行筛选,然后通过测定450nm处不同SEP抗原包被条件(包被液类型、包被环境)、封闭液类型及浓度、封闭时间、竞争反应温度、反应方式(预混反应、直接反应)下的OD值对检测条件进行优化,最后用灵敏度、批内变异、批间变异和加标样品回收率对方法进行评价。结果 SEP抗原最佳包被浓度为2.5 μg/mL,鼠单抗血清稀释度1:6000,酶标抗稀释度1:3000;反应1 h,最佳包被条件为磷酸盐缓冲液4 ℃过夜,10%脱脂乳封闭2 h,37 ℃直接竞争反应。此方法的线性回归方程为：y = 0.4166x - 0.7415(R2 = 0.9908),灵敏度为0.954 μg/mL,批内及批间变异系数均低于3 %,对人工污染的脱脂牛奶、LB液体培养基中肠毒素蛋白SEP的回收率高于98%。结论 本实验建立了一种能够快速检测葡萄球菌肠毒素SEP的ELISA方法。     

金黄色葡萄球菌肠毒素SEK的纯化及DAS-ELISA检测方法的建立与应用

本研究目的为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK的双抗夹心酶联免疫吸附方法。将构建的原核表达载体pET-28a(+)-ΔNspSEK转化入BL 21(DE3)pLysS细胞中诱导表达,经Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得重组SEK蛋白作为抗原。利用双抗夹心酶联免疫方法检测程序,确定抗SEK单克隆抗体及抗SEK多克隆血清的最佳稀释度,并使用该方法应用于检测SEK人工污染样品的加标回收率和茶多酚及乳酸链球菌素(Nisin)对7株sek阳性菌株的SEK蛋白分泌影响。结果表明,原核表达载体得到可溶性表达,重组SEK蛋白分子量约为27.7ku;建立的双抗夹心酶联免疫检测方法中,单克隆抗体最佳包被浓度为2.89μg/mL、抗血清的最佳稀释度为1:500,回归方程为y=0.2165x+0.1627,相关系数R~2=0.9993,最低检测限为0.1μg/mL;检测SEK人工污染脱脂奶、LB肉汤和牛肉糜中的加标回收率高达97%以上;并且,采用建立的方法测得茶多酚和Nisin的添加浓度在其MIC及以下浓度时,茶多酚对7株sek阳性菌株蛋白分泌抑制效果更明显。     

牛初乳中sIgA双抗夹心ELISA检测方法的建立

为定量检测牛初乳中sIgA,建立双抗夹心ELISA方法。以牛初乳中的sIgA为抗原,免疫新西兰白兔,制得抗血清,经纯化后作为包被抗体;利用简易过碘酸钠法对兔抗牛sIgA标记辣根过氧化物酶(HRP),制得酶标抗体;通过方阵滴定法确定ELISA最佳工作条件;进行特异性、重复性、稳定性实验并且检测牛初乳粉样本中的sIgA含量。结果:成功建立了一种定量检测牛初乳中sIgA的双抗夹心ELISA方法。该方法线性范围:15.625～1 000μg/L;最低检测限(LOD)为15.625μg/L;精密度为:批内CV=4.8%;批间CV=6.5%。     

测定三种乳蛋白抗原性间接竞争ELISA法的建立

为检测牛乳中主要致敏蛋白的抗原性,以商业兔抗αs-酪蛋白、兔抗β-乳球蛋白、兔抗牛血清白蛋白(BSA)多克隆抗体为一抗,标记HRP的羊抗兔Ig G为二抗,TMB为底物,对牛乳中主要致敏蛋白:αs-酪蛋白、β-乳球蛋白、BSA建立间接竞争ELISA(ic ELISA)。结果表明,αs-酪蛋白、β-乳球蛋白及BSA抗原包被质量浓度分别为5,2和2μg/m L。一抗最佳稀释倍数分别为1∶800,1∶400和1∶300。建立的三种蛋白的ic ELISA的线性检测范围分别为15.625~1 000 ng/m L、31.25~1 000 ng/m L和62.5~2 000 ng/m L。三种乳蛋白包被条件均为4℃,12 h,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶1 200,以1%的明胶作为封闭液。三种乳蛋白ic ELISA的3个浓度添加试验的批内及批间最大变异率分别为5.16%,7.46%,6.6%和6.78%,6.81%,6.06%,三种蛋白建立的ic ELISA回收率在94.34%~109.92%。表明所建立的方法重复性好,灵敏度高,可用于牛乳中此三种蛋白致敏性的测定。     

婴幼儿配方乳粉中IgG活性质量浓度的测定

为经济、快速、准确的测定婴儿配方乳粉中IgG的活性质量浓度,建立了ELISA试剂盒.以质量浓度为5 mg/L的兔抗牛IgG(37℃,3 h)加4 ℃过夜包被酶标板,1:250稀释度的HRP-兔抗牛IgG作为酶标二抗37℃温育1 h,TMB底物溶液(150μL的TMB使用液+30μL的H2O2+10 mL底物缓冲液)反应15 min,酶联检测仪读出oD450nm值.应用上述条件制作试剂盒.结果表明,应用试剂盒制作的标准曲线方程为γ=225.45x2-21.237x-1.4713.相关系数R2=0.9997,在4℃务件下保存至少2个月,回收率在0.93～1.06之间.应用试剂盒检测婴幼儿配方乳粉中的IgG,具有特异性强、灵敏、稳定和易于推广等优点.     

双抗夹ELISA法检测双歧杆菌反应条件的优化

研究利用双抗夹心酶联免疫吸附法（Double-antibody Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,Double-antibody Sand-wich ELISA）快速检测双歧杆菌（Bifidobacterium）的最佳反应条件。使用实验室自制的兔抗两歧双歧杆菌免疫血清和鼠抗两歧双歧杆菌免疫血清,利用方阵法对两种血清抗体的反应浓度进行筛选,之后对包被液、封闭液、封闭时间及底物作用时间进行比较和选择,从而确定运用双夹心ELISA法快速检测双歧杆菌的最佳反应条件。最佳反应条件分别为：兔抗两歧双歧杆菌免疫血清和鼠抗两歧双歧杆菌免疫血清反应浓度分别为1︰1280,1︰320,包被液浓度0.05 mol/L（pH值为9.6）的Na2CO3-NaHCO3,封闭液为质量分数为5%的BSA-PBS,封闭30min,底物作用时间为30 min。优化了双抗夹心ELISA法检测双歧杆菌的反应条件,为双歧杆菌的血清学检测提供了参考。     

酶联免疫吸附测定法检测白条鸭表皮组织中的脱氢松香酸

通过优化抗原包被质量浓度、抗体稀释倍数及二抗稀释倍数等参数,建立白条鸭表皮组织中脱氢松香酸（dehydroabietic acid,DHAA）含量的间接竞争酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）方法。白条鸭表皮组织中的DHAA用甲醇提取,经磷酸盐缓冲液稀释,使用酶标板进行检测。结果表明：最佳抗原包被质量浓度为1.0 μg/mL,最佳抗体稀释倍数为1∶6400,最佳二抗稀释倍数为1∶10000;ELISA方法的检测限及检测范围分别为41.0 ng/g和100.0～20150.0 ng/g;在100～5000 ng/g添加量范围内,DHAA回收率为78.2%～97.2%;实际样品分析结果显示,市场流通领域中白条鸭表皮组织中DHAA的检出率达到87%,含量范围为118.6～1199.2 ng/g。     

冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶ELISA检测方法的建立及应用

本文研究了冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶(MTG)的双抗体夹心酶联免疫检测方法(sandwich-ELISA法),以抗MTG兔多抗为包被抗体,抗MTG鼠单抗为检测抗体,再结合HRP标记的抗IgG1二抗,构成sandwich-ELISA检测方法,对冷冻鱼糜中是否添加MTG进行定量检测,防止冷冻鱼糜原料掺假。实验结果表明,包被抗体的最佳工作浓度是2.00μg/mL,检测抗体的最佳工作浓度为0.10μg/mL,酶标二抗的最佳稀释倍数为1:5000。方法的检测限为20 ng/mL,该检测方法在0.6 mg/mL~10 mg/mL范围内OD450值与MTG浓度的log值呈线性关系。建立掺假冷冻鱼糜样品模拟体系,测定其中MTG的添加量:MTG的添加回收率为94%以上,测定过程中回收率结果的板内变异系数为1.12%~4.02%,板间变异系数为5.43%~6.87%。经试验证明该方法灵敏度高,样品前处理简便,适用于冷冻鱼糜中MTG的定量检测。     

间接竞争ELISA法检测牛乳中β-乳球蛋白含量的准确性评价

研究建立了以β-乳球蛋白标准品为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG:HRP为二抗、邻苯二胺为底物的间接竞争酶联免疫检测法(indirect competitive enzyme-linked immu nosorbent,ELISA)。同时以反相高效液相色谱法定量检测相同样品中β-乳球蛋白含量,采用t检验方法来评价间接竞争ELISA的方法定量检测β-乳球蛋白的准确性。t检验方法结果显示:在显著水平α=0.05下,该间接竞争ELISA法检测β-乳球蛋白的测量值较为准确。     

磁微粒酶联免疫吸附法测定玉米中的伏马毒素B1

将磁微粒的偶联物替代酶标板作为固定相,用于酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测玉米中的伏马毒素B1(fumonisin B1,FB1)。在直接竞争ELISA反应中,分别引入羊抗兔抗体-磁微粒、蛋白A-磁微粒,并比较二者替代效果。通过对检测方法的优化,使用羊抗兔抗体、蛋白A与磁微粒的偶联物作为固定相的检出限分别为0.024μg/mL和0.030μg/mL。羊抗兔抗体-磁微粒偶联物替代酶标板后具有更低的检出限,为常规ELISA法检测限的三分之一。玉米样品中FB1回收率范围在76.4%~110.6%之间,相对标准偏差小于11%。研究建立了一种灵敏度高、稳定性好的FB1检测方法。     

Flow injection chemiluminescent determination of clenbuterol using GoldMag particles as carrier

A novel flow injection chemiluminescent (CL) enzyme immunoassay for clenbuterol analysis based on GoldMag particles is described. GoldMag is a new type of super-paramagnetic Fe₃O₄/Au composite particle used as a carrier in a flow injection CL system. Clenbuterol conjugated with ovalbumin (OVA) was immobilized onto GoldMag particles and the particles fixed in a micro-channel by an external electromagnetic field. The clenbuterol test sample and clenbuterol polyclonal antibody (Ab) were injected into the channel and incubated with GoldMag particles. Clenbuterol, immobilized on the magnetic particle surfaces, competes for polyclonal antibodies with clenbuterol in the test sample. The free Ab or Ab combined with the clenbuterol sample was washed away and the magnetic particles conjugated with Ag-Ab left in the micro-channel. Horseradish peroxidase (HRP)-labelled goat anti-rabbit immunoglobulin G (IgG) was added and reacted with clenbuterol polyclonal antibodies; excess goat anti-rabbit-HRP was then washed off. When chemiluminescent reagents were injected into the channel, emitted light from the magnetic particle surface was measured and recorded using a photomultiplier-based apparatus. The linear range of this novel method was 0.01-0.1 ng g^-1 and recovery of clenbuterol was 85-105% with a RSD of 3.2% (n = 11).     

恩诺沙星时间分辨荧光免疫分析方法的建立

目的：采用时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)技术建立高灵敏的恩诺沙星(enrofloxacin,ENR)快速检测方法。方法：以包被抗原(ENR-OVA)包被微孔板,与游离的恩诺沙星共同竞争抗恩诺沙星抗体,以铕(Eu3+)标记的羊抗兔抗体进行示踪。结果：方法的批内变异系数小于10%、批间变异系数小于15%,平均回收率为91.62%,灵敏度为5ng/L,可测范围为0.01～100μg/L,ED20、ED50和ED80分别为0.088、3.40μg/L和32.81μg/L。结论：ENR-TRFIA方法稳定性好、可测范围宽,具有很好的应用前景。     

直接竞争ELISA法检测蜂蜜中氯霉素残留

建立蜂蜜中氯霉素直接竞争酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测方法。以抗氯霉素单克隆抗体为包被原,氯霉素-辣根过氧化物偶联物为标记物,3,3’,5,5’-四甲基联苯胺作显色底物,对其主要影响因素,如标准品稀释液、包被温度、包被抗体稀释倍数等6?个因素进行优化,同时还对该方法的准确性和稳定性进行考察。结果表明：所建立的直接竞争ELISA标准曲线方程式为y=－17.425x＋97.509,相关系数R2为0.991?2,IC50值为0.63?ng/mL,检出限和线性检测范围分别为（0.04±0.01）ng/mL和0.10～4.17?ng/mL;另外整个检测反应过程耗时约为40?min。蜂蜜样品的检出限和定量限分别为0.15?ng/g和0.33?ng/g,添加回收率在97.58%～100.94%之间,批内变异系数和批间变异系数均小于11%,表明该方法具有高精确度和稳定性。     

Immumochromatographic assay for determination of hexoestrol residues

One-step membrane-based competitive colloidal gold-based immunoassays in lateral-flow formats for the rapid detection of hexoestrol (HES) were developed. Nitrocellulose membrane strip was separately coated with goat anti-rabbit IgG (control line) and HES hapten–OVA conjugate (test line). Anti-HES polyclonal antibody labelled with colloidal gold particles was firstly incubated with HES. A positive reaction as a result of the remaining antibody–gold conjugate combining with antigen coated on the membrane was obvious by visual detection, with detection limits for lateral flow of 10 μg/kg for detecting HES standard solution, and the limit of detection was 20 μg/kg for detecting the HES spiked in swine urine and liver. The assay time for test was less than 5 min, suitable for rapid testing on-site.     

免疫酶吸附法评价纳米金对抗体Fc端的吸附效果

以简单、快速的微波技术制备出粒径约为15nm左右纳米金溶胶。为测定该纳米金对兔IgG抗体的吸附,扫描得到溶液吸附抗体前后的光吸收图谱,可以明显看到溶液最大光吸收峰从518 nm转移到526 nm,这种现象表明纳米金能够很好地结合抗体。为评价纳米金和抗体Fc端的吸附效果,以兔IgG抗体和酶标羊抗兔抗体反应后,测定上清液中酶标抗体对酶底物显色后O.D值的变化,结果表明,纳米金对抗体Fc端的吸附率在92%以上,证明该纳米金吸附主要是在抗体的Fc端。     

动物性食品中磺胺二甲嘧啶快速检测方法

根据竞争抑制免疫层析原理,应用胶体金免疫层析技术进行磺胺二甲嘧啶在鸡肉和鲫鱼中的残留检测研究。磺胺二甲嘧啶半抗原-OVA和羊抗兔二抗分别作为检测带(T线)和质控带(C线)包被在硝酸纤维素膜上,金标抗体喷涂在玻璃纤维垫上,制成免疫层析快速检测试纸条。所建立的检测体系对标准溶液的灵敏度达到1μg/L。成功检测了鸡肉和鲫鱼中的磺胺二甲嘧啶残留。该方法灵敏度高,所用试剂无毒、无污染,无需借助仪器,样品前处理简便,快速,检测过程可在10 min内完成,可以作为现场快速检测动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留的有效手段。     

可视化蛋白芯片法同时检测牛乳中残留的磺胺类和喹诺酮类药物

目的：利用可视化蛋白芯片分析技术对牛乳中磺胺类和喹诺酮类抗生素多残留的同时检测。方法：采用间接竞争法反应原理,将磺胺类和喹诺酮类药物的人工抗原以微阵列形式固定于微孔板底部,制备成微孔板生物芯片阵列,并依次与磺胺类和喹诺酮类单克隆抗体、纳米银标记羊抗鼠IgG反应,最后用纳米银增强法显色,并采用可视化芯片扫描仪对微孔板显色结果进行快速扫描成像,图像采用芯片分析软件处理。结果：本法磺胺嘧啶和恩诺沙星线性范围为分别为0.3～7.2 ng/mL和0.4～18 ng/mL。空白牛乳中加标磺胺嘧啶（0.5、2.0、5.0 ng/mL）和恩诺沙星（0.5、3.0、15.0 ng/mL）,结果牛乳中2 种药物的加标回收率分别为83%～110%,且相对标准偏差均在10%以内。结论：本法能够用于牛乳样本中磺胺类和喹诺酮类药物的残留的快速初筛。     

基于Arah6的花生间接竞争ELISA检测方法的建立

建立了基于花生主要过敏原蛋白Arah6的间接竞争酶联免疫检测法,实现了对食物中花生的定量检测。利用花生过敏原Arah6纯品免疫新西兰大白兔,制得兔抗Arah6的多克隆抗体,以Arah6纯品作为包被抗原、自制抗体为一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为二抗,确定了包被抗原质量浓度为1μg/mL,一抗最佳稀释度为1:50000,酶标二抗稀释度为1:5000。此检测方法对Arah6的定量检测范围为16.5～10000ng/mL(折合成含花生的含量,约为165ng/mL～100μg/mL),抑制方程为抑制率I=21.418lgC-6.0633(C为Arah6的质量浓度,单位ng/mL),IC50为414.6ng/mL,相关系数R2=0.9989。该检测方法灵敏度高,检测范围广,适用于食品中花生现场快速检测。