鱼肉蛋白肽在模拟胃肠消化吸收过程中的抗氧化活性和生物利用度

以鳕鱼鱼肉蛋白肽为研究对象,构建体外胃肠消化模型和Caco-2细胞吸收模型,模拟连续的胃肠消化、吸收过程,测定抗氧化活性和生物利用度。结果显示:在模拟胃肠消化过程中,鱼肉蛋白肽的水溶性维生素E抗氧化能力(TEAC)变化不显著(p0.05),DPPH自由基清除率在胃消化阶段下降而在肠消化阶段升高(p0.05),但低于消化前的水平(p0.05)。在模拟转运2 h过程中,鱼肉蛋白肽吸收产物的肽氮含量逐渐增加,TEAC和氧自由基抗氧化能力(ORAC)显著升高(p0.05)。鱼肉蛋白肽的生物利用度显著高于鱼肉(9.1%),且分子量最小的蛋白肽的生物利用度最高(46.2%)。鱼肉蛋白肽经胃肠消化吸收后,具有一定的抗氧化活性且生物利用度较高,为鳕鱼蛋白肽的开发利用提供了理论依据。     

糖基化鳕鱼小清蛋白消化过程中的致敏性

采用间接竞争ELISA、高效液相色谱等技术研究糖基化鳕鱼小清蛋白(PV)在体外模拟消化过程中致敏性及结构的变化规律。结果显示:糖基化PV经消化后其IgE/IgG结合能力显著降低,并于胃肠消化2h时达到最低,3h时略有增加;胃蛋白酶酶解产生的分子量500Da的肽段在胰蛋白酶的作用下会重新聚集;消化产物都出现新的发射峰并产生红移,发射峰的荧光强度也呈先降低后增加趋势。说明鳕鱼PV致敏性的变化与其结构的改变密切相关,糖基化改性结合模拟人体胃肠道消化可有效降低蛋白的致敏性。     

超声处理对大豆7S蛋白潜在致敏性的影响

利用超声波改性处理大豆7S蛋白,并评估超声处理产物体外消化性及消化产物抗原性和潜在致敏性的变化。结果表明,7S蛋白耐唾液、胃液消化,但其在300 W超声处理80 min后易被十二指肠消化;进一步利用体外免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G结合能力评估消化产物抗原性的强弱,超声处理7S蛋白后,随着超声处理时间(0~120 min)的延长,其消化产物的抗原性总体上呈现先升高后降低的趋势,在超声100 min时,消化产物的抗原性最低;利用体外Ig E结合能力评估其潜在致敏性,随超声处理时间(0~120 min)的延长,大豆7S蛋白消化产物的Ig E结合能力呈现先升高后降低的趋势,超声80 min时,其消化产物Ig E结合能力最低。研究结果表明超声80 min具有降低大豆7S蛋白潜在致敏性的作用。     

热蒸加工对大菱鲆过敏原免疫原性的影响

目的 研究热蒸加工方式对大菱鲆(Scophthatmus maximus)过敏原免疫原性的影响。方法 利用热蒸处理对大菱鲆鱼肉进行了不同时间的加工, 利用SDS-PAGE测定大菱鲆蛋白质组分和蛋白质含量的变化, 并采用免疫印迹和间接ELISA分析热蒸加工对过敏原免疫原性的影响。结果 大菱鲆经过热蒸加工后, 其肌肉组分中分子量在40 ~65 kDa的蛋白有很大程度地降解, 而分子量在10 ~12 kDa的蛋白组分有增加的现象。免疫印迹的结果表明热蒸后的大菱鲆蛋白质组分与血清IgE特异性结合的能力减弱, 但与兔源小清蛋白抗体有强烈地反应, 特别是在分子量18 kDa的位置出现了一条能够与人血清IgE结合的蛋白质, 有可能是新的过敏原组分。结论 热蒸加工可以降低大菱鲆过敏原的免疫活性, 但在加工过程中可能有新的过敏原条带产生, 在进行过敏原检测时有必要考虑加工方式对过敏原结构和活性的影响, 以便得到更可靠的结果。     

蟹类主要过敏原的模拟肠胃液消化及其对过敏原活性的影响

目的:通过模拟肠胃液消化试验,分析锯缘青蟹肌肉中过敏原(原肌球蛋白)的消化特性以及消化对过敏蛋白致敏性的影响.方法:采用美国药典提供的模拟胃、肠液配方,测定青蟹原肌球蛋白和肌原纤维蛋白在体外模拟肠胃环境中的消化稳定性.以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Western-blot)进行分析.结果:在模拟胃液反应中,非过敏原蛋白尤其是肌球蛋白重链和肌动蛋白等被胃蛋白酶快速降解,而原肌球蛋白在60 min时仍未被完全分解.在模拟肠液反应中,相对于致敏蛋白,肌球蛋白重链、肌动蛋白等非过敏蛋白在较短的时间内被分解,原肌球蛋白尽管120 min后几乎被完全分解,但会产生一些较稳定的蛋白降解片段.以免疫印迹法检测过敏患者血清,结果分子质量为34 kDa的原肌球蛋白降解产物仍具有过敏原性.结论:蟹类过敏蛋白相对于非过敏蛋白具有较高的消化稳定性,而且其高分子质量降解产物仍可能引起过敏反应.     

饼干模型对小麦及花生过敏原消化稳定性和免疫活性的影响

食品加工或食物基质可以不同程度地影响过敏原消化稳定性和免疫原性。然而,对食品加工和食物基质对 食物模型中过敏原的影响却知之甚少。本实验通过体外模拟胃肠消化的方式,包括模拟口腔咀嚼、胃部消化和十二 指肠消化,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹的方法,分析焙烤模型饼干中小麦过敏原和花生 过敏原的消化特性和免疫原性。结果显示：小麦和花生蛋白均可被胃蛋白酶迅速水解,醇溶蛋白、谷蛋白等致敏原 被降解成低分子质量多肽;可溶性蛋白中花生过敏原Ara h 1和Ara h 3基本消失,Ara h 2/6耐受胃肠消化;酶联免疫 吸附测定结果显示,消化后饼干中过敏原的致敏性降低。综合以上结果表明,饼干模型的消化性质基本不受焙烤加 工和其他基质的影响,免疫原性因致敏原被消化而降低。     

加热联合酶解大豆7S蛋白的分子结构及抗原性研究

选用不同加热预处理条件、不同蛋白酶处理大豆7S蛋白,SDS-PAGE考察酶解后大豆7S蛋白的降解情况,间接竞争ELISA法考察酶解物的抗原性。结果表明:加热预处理联合酶解可显著增大β-伴大豆球蛋白的降解程度,β亚基消化程度得到极大提升,α亚基、α'亚基几乎完全被降解,在相同酶解时间下,胰蛋白酶的酶解速度快于胃蛋白酶;加热预处理联合酶解大幅降低了β-伴大豆球蛋白的抗原性,胰蛋白酶的效果优于胃蛋白酶,经80℃加热10 min预处理再经胰蛋白酶处理,大豆7S蛋白的抗原性降低了79.99%,而胃蛋白酶最优条件下最多仅降低50.4%; SDSPAGE结果表明,胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物中出现了抗消化肽段,经过质谱鉴定,均来自于β-伴大豆球蛋白的α亚基。     

利用牛奶过敏者血清检验牛奶中过敏原酶解程度的研究

利用对牛奶过敏者和对牛奶不过敏者的血清作为“一抗”,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)的方法,检测牛奶水解后对牛奶过敏者血清的结合能力,从而确定牛奶中过敏原蛋白的最佳水解消除条件,降低牛奶及奶制品对牛奶过敏者的致敏性,达到牛奶过敏人群可以饮用的标准。结果表明:胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶共同水解牛奶的最佳条件是酶与底物质量比W(E/S)=4%,pH1.5(胃蛋白酶)和pH8.0(胰蛋白酶和木瓜蛋白酶),温度40℃(胃蛋白酶和胰蛋白酶)和45℃(木瓜蛋白酶),水解时间3h,用酶标仪在492nm测得其水解后奶样与过敏者血清结合的OD值已降到了牛奶不过敏者血清与未水解牛奶结合的OD值水平,达到了消除过敏原的效果。     

脂质过氧化物对花生过敏原致敏性的影响

目的 阐明加工过程中脂质过氧化物对花生过敏蛋白Ara h 1结构和过敏原性的影响。方法 通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,圆二色谱法和内源荧光光谱法研究不同脂质过氧化物[2,2-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐(2,2’-azobis(2-methylpropanimidamide)dihydrochloride,AAPH)和丙烯醛]对花生过敏蛋白Ara h 1的结构影响,进一步采用免疫印迹技术、酶联免疫法,模拟胃液消化和细胞模型分析其过敏原性的变化。结果 脂质过氧化物修饰后的花生过敏蛋白Ara h 1二级结构变得更无序,内源荧光强度降低;花生过敏蛋白Arah1的免疫球蛋白E结合能力、消化稳定性和释放活性介质能力均降低。结论 在花生加工过程中脂质过氧化物能够改变花生过敏蛋白的结构,降低其过敏原性。     

海洋鱼蛋白低聚肽结构和抗氧化活性的体外消化稳定性

本研究通过体外模拟胃肠道消化海洋鱼蛋白低聚肽,运用高效凝胶过滤色谱、紫外全波长扫描、圆二色光谱表征其消化前后结构变化,测定其消化前后DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除能力、铁离子还原能力(FRAP)及氧自由基吸收能力(ORAC)的变化,以探究模拟胃肠道消化对海洋鱼蛋白低聚肽结构及抗氧化活性的影响。分子量分布数据揭示了海洋鱼蛋白低聚肽中分子量为150～1000u的组分为其主要组成部分,所占比例最高可达88.39%;紫外全波长扫描、圆二色光谱扫描表明海洋鱼蛋白低聚肽对胃蛋白酶有很强的抗消化稳定性以及对胰蛋白酶有较好的抗消化稳定性。在浓度1～15 mg/mL范围内,海洋鱼蛋白低聚肽的DPPH自由基清除率与其浓度成正相关,最高为67.86%;ABTS自由基清除能力、FRAP值及ORAC值三个抗氧化指标均显示海洋鱼蛋白低聚肽在消化后其抗氧化活性均有一定程度的提高,其中ORAC值在先胃蛋白酶后胰蛋白酶消化后提高最显著(p0.01)。总之海洋鱼蛋白低聚肽的结构和抗氧化活性均具有抗消化稳定性。     

奶酪中乳酸菌的分离筛选及其对小清蛋白的降解性能初步评价

为筛选可降解鱼类主要过敏原小清蛋白(parvalbumin,PV)的乳酸菌,该研究以产蛋白酶作为初筛标准从奶酪中分离筛选获得8株乳酸菌,经16S rDNA测序鉴定为Lactobacillus plantarum 4株,Lactobacillus casei 2株,Enterococcus faecalis 2株.利用这...     

Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff

Whiff (Lepidorhombus whiffiagonis) is a fish frequently consumed in Spain. Lep w 1, its major allergen, is a calcium‐binding β‐parvalbumin. The resistance of Lep w 1 to heat denaturation and to digestion were studied by circular dichroism spectroscopy and by in vitro gastric digestion systems. Purified Lep w 1 was thermally stable up to 65°C at neutral pH. Calcium depletion resulted in a change of its structure as determined by circular dichroism spectroscopy. A partial loss of structure was also observed at acidic pH; however, the allergen retained its full IgE‐binding ability. The partially denatured Lep w 1 was easily digested by pepsin within 2 min. Further, the IgE reactivity of proteins extracted from cooked fish and their stability to proteolysis were analyzed. The extract revealed a higher number of IgE reactive bands than an extract from uncooked fish. IgE binding to these proteins could not be inhibited by an extract from uncooked fish. In contrast to a raw fish extract, the cooked extract showed higher resistance to pepsinolysis. The stability of Lep w 1 to thermal denaturation and digestion explains the high allergenicity of whiff.     

Comparative study of in vitro digestibility of major allergen,tropomyosin and other proteins between Grass prawn (Penaeus monodon) and Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei)

BACKGROUND: Stability in simulated gastric fluid is supposed to be an important parameter for the estimation of food allergenicity. In the present study, the digestive stability of allergenic protein tropomyosin (TM) and other food proteins from Grass prawn and Pacific white shrimp in simulated gastric fluid (SGF) and simulated intestinal fluid (SIF) digestion assay system was investigated and comparatively studied by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS‐PAGE), western blotting, and inhibition enzyme‐linked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: In the SGF system, proteins such as actin and myosin heavy chain (MHC) were rapidly degraded within a short period of time, while TM was relatively resistant to pepsin digestion. In the SIF system, MHC was also easily decomposed, while TM and actin were resistant to digestion. Western blotting using a specific polyclonal antibody against TM indicated that the degradation pattern of shrimp TM by SGF and SIF was almost unaffected by the presence of other myofibrillar proteins. Further study by IgE immunoblotting and inhibition ELISA using sera from crustacean‐allergic patients indicated that IgE binding of TM was decreased. CONCLUSION: Proteinase digestion is effective in reducing IgE binding of shrimp TM. It is also of interest to notice that Pacific white shrimp TM had higher digestion stability than Grass prawn TM. However, Pacific white shrimp TM revealed enhanced IgE binding over that of TM from Grass prawn and thus it is possibly more allergenic. Copyright © 2010 Society of Chemical Industry     

鲤鱼小清蛋白的纯化及其过敏原性鉴定

目的：分离纯化鲤鱼小清蛋白(parvalbumin),并对其进行过敏原性鉴定,为建立鱼类过敏原检测技术奠定基础。方法：采用硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化鲤鱼小清蛋白,采用点杂交和特异性IgE 检测试剂盒筛选鱼类过敏者血清,应用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹技术分析确定纯化目标蛋白的性质。结果：硫酸铵分级盐析和阴离子交换层析纯化方法可以得到电泳纯单一目标蛋白;小鼠抗蛙小清蛋白单克隆抗体免疫印迹实验表明,所得纯化蛋白是小清蛋白。此外,免疫杂交结果显示,鱼类过敏者血清能与纯化的小清蛋白发生特异性结合,从而证实了鲤鱼小清蛋白的过敏原性。     

加工方式对鱼饼小清蛋白免疫原性和致敏性的影响

采用加热、高温高压、副干酪乳杆菌发酵和副干酪乳杆菌发酵联合高温高压分别处理白鲢肌肉并加工成鱼饼,通过酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）和傅里叶变换红外光谱分析不同处理组鱼饼中小清蛋白（parvalbumin,PV）免疫原性和二级结构的变化;构建BALB/c小鼠过敏模型,通过小鼠过敏症状评分、血清中免疫球蛋白E抗体水平、组胺和细胞因子水平的变化,分析加工方式对PV致敏性的影响。结果表明,与鱼肉天然PV相比,高温高压、发酵和二者联合处理制备的鱼饼中PV免疫球蛋白G结合能力消减率最高分别为50.6%、34.7%和68.5%;α-螺旋相对含量较天然鱼肉PV分别降低了10.7%、13.3%和17.3%,而β-折叠相对含量分别增加7.8%、5.1%和14.8%,而加热组均无明显变化。小鼠过敏模型结果显示,与加热组相比,其他加工处理组蛋白致敏小鼠过敏症状明显减弱,血清中组胺质量浓度和Th2型细胞因子（白细胞介素（interleukin,IL）4、IL-5和IL-13）的相对含量显著降低（P＜0.05）,小鼠血清中免疫球蛋白E抗体水平显著降低（P＜0.05）,其中高温高压联合发酵组PV致敏性降低效果最佳。综上,单一的高温高压和发酵对鱼饼PV的α-螺旋相对含量降低、折叠化程度增加,以及免疫原性和致敏性降低的效果均不如二者联合处理,但都能够减轻免疫小鼠的Th2型细胞免疫应答反应,进而抑制了其过敏反应,其中高温高压联合发酵加工处理对鱼类主要过敏原PV的免疫原性和致敏性影响最为显著。     

苦荞凝集素的稳定性及体外消化性

目的:从苦荞种子中分离得到一种凝集素(tartary buckwheat lectin,TBL),研究其酸碱、热稳定性及体外消化性。方法:采用酸性缓冲液浸提脱脂荞麦粉及阴离子交换层析纯化凝集素,TBL分别经沸水浴加热不同时间、不同pH处理、模仿胃液、模仿胰液消化后,采用SDS-PAGE及灰度扫描分析,研究其稳定性及体外消化性。结果表明:选用pH4.7浸提缓冲液可简化提取工艺,采用一步层析可得到电泳纯TBL。沸水浴加热60 min时,TBL仍可保留50%以上。在pH4~12条件处理30 min后,BTL的保留率均在80%以上。体外消化实验表明,TBL对人工模拟胃液有一定抗性,降解一半TBL所需时间为10 min,而TBL在人工模拟肠液中很难消化,即使作用时间为50 min时,TBL也未发生明显降解。将TBL沸水浴加热30 min后再进行体外消化实验,发现在模拟肠液及模拟胃液中,仅处理10 min时,SDS-PAGE结果中TBL蛋白条带完全消失,表明被TBL被消化酶完全降解。结论:天然TBL具有良好的稳定性,耐热、耐酸碱、耐胰蛋白酶消化,在胃蛋白酶液中降解也较为缓慢。预加热处理可明显提高TBL在模拟胃液及模拟肠液中的消化率。     

纳豆芽孢杆菌液态发酵对花生理化指标 及其蛋白在消化过程中致敏性的影响

为探究经发酵后的花生营养价值及其蛋白进入体内后致敏性的变化,更好地将微生物发酵应用于花生制品加工生产中。本实验以花生浆(RPP)为研究对象,依次采用高压蒸汽(121 ℃,20 min)、纳豆芽孢杆菌发酵12~60 h处理后,对其冻干产物进行理化性质检测,同时采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测其蛋白成分在模拟胃肠消化过程中致敏性的变化。结果表明,RPP经高压蒸汽处理后,其蛋白分子量、致敏性、可溶性蛋白含量降低,水解度和多肽含量增加;经纳豆芽孢杆菌进一步发酵后,随着发酵时间的延长,其蛋白分子量、致敏性降低,水解度增加,多肽和可溶性蛋白含量先增加后降低,且其水解度、多肽和可溶性蛋白含量的增加率最高分别为106.9%(发酵60 h)、339.6%(发酵48 h)、42.8%(发酵36 h)。在模拟消化过程中,花生致敏性的降低主要发生在胃液消化阶段,胃肠液连续作用对花生致敏性的影响比其单一作用效果更明显。结合理化指标及致敏性等因素可知,经纳豆芽孢杆菌发酵36 h的花生浆为最好的发酵花生产品,具有营养价值较高、理化性质较好、致敏性较低等特点。     

鲈鱼在4℃冷藏过程中的肌肉品质变化

目的：探究4℃冷藏过程中鲈鱼肌肉品质的变化。方法：测定4℃冷藏过程中鲈鱼肌肉pH值、菌落总数、总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen,TVB-N）含量、K值和质构等指标,综合评价鲈鱼生理生化品质的变化,采用Masson染色和免疫组化分析评价组织形态学变化,利用酶解荧光肽底物测定特异性酶解胶原蛋白的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）活力变化。结果：鲈鱼在贮藏期间pH值呈先下降后升高趋势,菌落总数、TVB-N含量和K值随贮藏时间的延长而增加,并在第8天超过临界值。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果显示,贮藏至6 d鲈鱼肌肉蛋白组成没有明显变化,而在第8天肌球蛋白重链降解明显。Masson染色和I型胶原免疫组化分析结果显示,随贮藏时间的延长,肌内膜逐渐被降解,至第12天,肌膜I型胶原蛋白和肌纤维之间出现明显间隙。MMPs活力随贮藏时间的延长而明显增加,而鱼肉硬度不断下降。结论：鱼类冷藏期间肌肉的软化与胶原蛋白分解密切相关,而MMPs对I型胶原蛋白的降解可能是鱼死后肌肉软化的主要原因。     

In vitro digestion and characterisation of 2S albumin and digestion‐resistant peptides in pecan

The 2S albumins are one of the major protein families involved in severe food allergic reactions to nuts, seeds and legumes, thus potentially making these proteins clinically relevant for allergic sensitisation and potential diagnostic markers. In this study, we sought to purify native 2S albumin protein from pecan to further characterise this putative allergen. The purified 2S albumin, Car i 1, from pecan was found to be resistant to digestion by pepsin in simulated gastric fluid (SGF) and comparatively stable to proteolysis by trypsin and pancreatin in simulated intestinal fluid (SIF). Digestion of purified Car i 1 in SGF and SIF resulted in formation of different digestion‐resistant peptides that were capable of binding IgE antibodies from allergic individuals. Digestion stability of Car i 1 and formation of digestion‐resistant antigenic peptides may explain why it is a potent sensitising protein in pecan for susceptible individuals. The observation that digestion‐resistant peptides are able to bind IgE implies that pecan can trigger systemic allergic reactions even after digestion in the stomach and small intestine.     

Comparative study of in vitro digestibility of major allergen tropomyosin and other food proteins of Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)

BACKGROUND: China is the largest producer and consumer of aquatic products in the world; however, many people in China suffer from allergies upon consuming crab. Stability in simulated gastric fluid is regarded as an important parameter for the estimation of food allergenicity. RESULTS: The digestive stability of allergenic protein tropomyosin (TM) and other food proteins from Chinese mitten crab in simulated gastric fluid (SGF) and simulated intestinal fluid (SIF) digestion assay systems was investigated and compared by SDS‐PAGE, western blot and inhibition ELISA. In the SGF system, proteins such as the original band of myosin heavy chain (MHC) and actin were rapidly degraded within a short period of time, while TM was relatively resistant to pepsin digestion. In the SIF system, MHC was easily decomposed, while TM and actin were similarly resistant to digestion. Further study by IgE immunoblotting and inhibition ELISA using sera from crab‐allergic patients indicated that allergenicity of TM was partially decreased. CONCLUSION: Chinese mitten crab major allergen TM was resistant to pepsin while relatively susceptible to trypsin and chymotrypsin digestion. Both SDS‐PAGE using purified TM and western blot using myofibrillar proteins indicated that the degradation pattern of TM by SGF and SIF was not affected by the presence of other myofibrillar proteins. Inhibition ELISA results revealed that proteinase digestion is effective in reducing the allergenicity of crab TM. Copyright © 2010 Society of Chemical Industry