叠氮溴化丙锭-羟基萘酚蓝-环介导等温扩增法检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌

将叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）、羟基萘酚蓝（hydroxynaphthol blue,HNB）与环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术相结合,建立一种可视化PMA-HNB-LAMP方法快速检测畜禽肉中单核细胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）。结果表明,当PMA终质量浓度为5.0 μg/mL、孵育和曝光时间均为15 min时,可有效抑制105 CFU/mL的单核细胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶链式反应扩增,而对活菌DNA的扩增不具有抑制作用。LAMP反应体系中HNB终浓度为210 μmol/L时,检测显色结果肉眼可见。该方法的纯菌液灵敏度为2.4×102 CFU/mL,人工污染肉制品的检出限为2.3×104 CFU/ mL。分别采用国标法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法检测20 份市售畜禽肉样,3 种方法的单核细胞李斯特菌检出率分别为5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解决LAMP法的假阳性问题,并且具有操作简单、可视性强的优点。     

环介导等温扩增技术快速检测肉中金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术建立了对肉中金黄色葡萄球菌检测的方法。实验中,使用了最新的Bst 2.0 Warm Start DNA聚合酶完成LAMP扩增反应,并针对金黄色葡萄球菌所特有的保守性耐热核酸酶基因（nuc）设计得到了一套LAMP扩增引物。对LAMP法和PCR法的检测灵敏度进行了比较,同时对人工污染肉中的金黄色葡萄球菌进行检测。结果表明：所建立的LAMP法能够特异性的检测金黄色葡萄球菌,并且检测金黄色葡萄球菌纯菌的灵敏度为2.01×10~0CFU/m L,是普通PCR检测灵敏度的100倍。在检测肉中金黄色葡萄球菌时,检测限为2.01×10~1CFU/m L。因此,本实验所建立的LAMP法检测肉中金黄色葡萄球菌的方法,具有灵敏、快速以及简便等的优点,是一种具有很好的发展前景的检测手段。     

基于可视化环介导等温扩增技术快速检测金黄色葡萄球菌

应用环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）建立基于颜色判定的快速、灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法。根据金黄色葡萄球菌特异性靶基因SAR0395设计LAMP引物,建立可视化LAMP检测方法。优化的反应体系为：1.6 μmol/L内引物（FIP和BIP）,0.2 μmol/L外引物（F3和B3）,4.0 mmol/L MgSO4,1.0 mmol/L dNTPs,0.4 U/μL Bst 2.0 WarmStart? DNA聚合酶,120 μmol/L羟基萘酚蓝,扩增温度60 ℃,扩增时间60 min。在可视化LAMP体系中添加两条环引物（LF和LB）反应时间可缩短至20 min。该可视化LAMP反应60 min,其基因组灵敏度可以达到0.010 3 fg/μL,菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL;利用46 株金黄色葡萄球菌和24 株非金黄色葡萄球菌证实该可视化LAMP具有良好的特异性和可靠性。本研究中建立的可视化LAMP可为金黄色葡萄球菌的快速检测提供一种新的技术。     

环介导等温扩增检测猪血中金黄色葡萄球菌

采用环介导等温扩增(LAMP)技术,检测猪血中金黄色葡萄球菌.以金黄色葡萄球菌(CMCC10201)的femA基因作为靶序列,设计LAMP和PCR引物,通过凝胶电泳,判断检测结果.对8株常见致病菌进行LAMP特异性实验,表明对金黄色葡萄球菌的检测具有很高的特异性;LAMP检测金黄色葡萄球菌的灵敏度为8.7CFU/mL,直接检测猪血中金黄色葡萄球菌的检出限为8.7×102CFU/mL,PCR法的检出限为8.7×103CFU/mL.本实验所建立的快速检测猪血中金黄色葡萄球菌的LAMP法具有较高的特异性和敏感性,能够满足快速检测的需要.     

叠氮溴乙锭-环介导等温扩增法快速检测空肠弯曲菌活菌

目的建立叠氮溴乙锭(ethidium monoazide bromide, EMA)-环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测空肠弯曲菌活菌的方法。方法以空肠弯曲菌mapA基因为检测靶基因,纯培养物提取模板进行LAMP反应,检测空肠弯曲菌LAMP灵敏度、EMA曝光照射时间试验和使用浓度试验。结果空肠弯曲菌LAMP检测灵敏度为800 CFU/mL;曝光照射时间为5 min; EMA终浓度50μg/mL以下时不会抑制空肠弯曲菌活菌的DNA扩增,终浓度为1μg/mLEMA能有效抑制4×10~4CFU/mL空肠弯曲菌死菌扩增; 1%活菌混合体系中EMA-LAMP检测结果为阳性。结论 EMA-LAMP方法能有效快速检测空肠弯曲菌活菌。     

基于核酸等温扩增技术金黄色葡萄球菌检测的研究进展

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为一种食源性致病菌,是导致食品安全和公共卫生事件的主要病原体之一,开发快速准确的金黄色葡萄球菌检测技术是保障食品安全和提高食源性致病菌防控水平的关键措施。核酸等温扩增技术具有检测速度快、灵敏度高和设备简单等优点,在金黄色葡萄球菌检测方面具有很大的应用前景。基于此,该文简要介绍了核酸等温扩增技术的原理及优缺点,主要阐述了核酸等温扩增技术在金黄色葡萄球菌检测上的应用,并总结了目标产物检测技术,为金黄色葡萄球菌等温扩增快速检测技术的开发提供理论支持,为食品安全控制和食源性致病菌监控工作奠定基础。     

金黄色葡萄球菌LAMP可视化快速检测方法的建立

建立金黄色葡萄球菌LAMP可视化检测方法。通过对2套引物的筛选,最终选取nuc基因的6条引物建立LAMP反应体系。整个反应在63℃恒温条件下进行45min,即可通过肉眼直接对反应结果进行判定。对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为0.001ng/μL,且与其他致病菌无交叉反应。该方法快速、特异性高,操作简便,适合基层快速检测。     

应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究

建立环介导等温扩增技术(Loop-medisothermalamplification,LAMP)快速检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus).根据金黄色葡萄球菌nuc基因序列中的保守区域设计了4条特异性引物,在65℃等温条件下,45min即可扩增出梯形条带.LAMP检测金黄色葡萄球菌纯培养物的...     

叠氮溴化丙锭-qPCR法定量检测植物乳杆菌

目的 将叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMA)与实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)相结合,建立一种活性植物乳杆菌定量检测的PMA-qPCR方法.方法 首先进行引物探针特异...     

畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌可视化LAMP检测方法的研究

目的:建立一种设备要求简单、结果可视化的用于定性检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的快速检测方法。方法:通过对羟基萘酚蓝(hydroxynaphthol blue,HNB)浓度、叠氮溴化丙啶(propidium monoazide,PMA)浓度等的优化,结合环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),建立一种PMA-HNB-LAMP联用的可视化的用于快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的方法,对其特异性、灵敏度进行测试,并用于人工污染样品和实际样品的检测。结果:本研究成功建立了LAMP扩增体系,并通过添加210 μmol/L HNB到LAMP扩增体系中,得到了差异明显的阴阳性结果。建立的HNB-LAMP法特异性强,其纯菌液灵敏度为10⁴ CFU/mL,样品基质灵敏度为10⁵ CFU/mL。本研究中用于处理样品的PMA浓度为10 μg/mL,处理条件为室温下避光孵育5 min,曝光15 min。在检测人工污染的样品时,PMA-HNB-LAMP法和传统微生物法检测结果一致。结论:本研究成功建立了可快速检测畜禽肉中金黄色葡萄球菌活菌的可视化PMA-HNB-LAMP法。     

重组酶聚合酶恒温扩增结合乳胶微球试纸条快速检测金黄色葡萄球菌

通过建立一种将重组酶聚合酶恒温扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)与乳胶微球试纸条(latex microsphere test strips,LMTS)相结合的方法,快速检测金黄色葡萄球菌。根据金黄色葡萄球菌保守区序列(nuc)设计特异性引物,经RPA扩增后用LMTS检测,确定RPA-LMTS检测金黄色葡萄球菌的灵敏度和特异性。灵敏度结果显示RPA-LMTS检测限为500 fg DNA和1.2×101 CFU/mL纯菌液;特异性结果表明与沙门氏菌、大肠杆菌O157∶H7、志贺氏菌、产气肠杆菌和单增李斯特菌无交叉反应,特异性良好;用食物样品评估RPA-LMTS检测效果,结果显示经过增菌3小时后,RPA-LMTS可检测1.2×100 CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。     

二重环介导等温扩增法快速检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌

为建立能够同时检测乳粉中沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的二重环介导等温扩增(loop-mediated isother-mal amplification,LAMP)方法.针对沙门氏菌invA基因、金黄色葡萄球菌nuc基因保守区域设计LAMP引物,优化引物浓度,并通过熔解曲线分析判断扩增靶标来源,建立同时检测沙门氏菌和金黄色...     

环介导等温扩增法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

建立一种应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistan Staphylococcus aureus,MRSA)中mecA和spa基因的检测方法。以金葡菌和其他相关菌种为试验对象,分别用聚合酶链式反应(ploymerase chain reaction,PCR)和LAMP方法检测mecA和spa基因。结果表明：LAMP法在64℃等温条件下可在60min内成功扩增基因,且与传统PCR方法结果相同;通过琼脂糖凝胶电泳可知,LAMP对mecA和spa基因的检测限分别为每菌管102个和10个细胞;肉眼可检测到的mecA和spa基因的检测限分别为每菌管103个和10个细胞;然后用LAMP法检测人工污染原料乳样本中MRSA,用LAMP法检测原料乳中的mecA和spa基因与PCR方法显示出相同的结果。LAMP方法可快速检测mecA和spa基因,此方法可应用于原料乳中MRSA的检测。     

金黄色葡萄球菌RAA-LFD快速检测方法的建立与应用

靶向金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)保守基因(nuc)序列设计特异性引物,经引物筛选和反应条件的优化,建立金黄色葡萄球菌的重组酶等温扩增(recombinase aided amplification,RAA)结合侧流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的快速检测...     

恒温隔绝式聚合酶链式反应检测食品中金黄色葡萄球菌

建立一种恒温隔绝式聚合酶链式反应(insulated isothermal polymerase chain reaction,iiPCR)检测食品中金黄色葡萄球菌的方法.根据nuc基因设计特异性引物、探针,并探索针对食品样品快速提取金黄色葡萄球菌模板DNA的方法;通过优化引物、探针及模板的用量,对iiPCR的特异性、...     

免疫磁珠-环介导等温扩增快速检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌

建立免疫磁珠分离（immunomagnetic separation,IMS）联合环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术检测牛肉中鼠伤寒沙门氏菌与金黄色葡萄球菌的方法。用生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌抗体和生物素标记的金黄色葡萄球菌菌体蛋白抗体对链霉亲和素磁珠进行功能化,从牛肉中捕获和分离目标致病菌。结果表明：经优化后,每毫克磁珠与10 μL鼠伤寒沙门氏菌抗体偶联,400 μL鼠伤寒沙门氏菌免疫磁珠在45 min内对104 CFU/mL鼠伤寒沙门氏菌的捕获率为52.16%;每毫克磁珠与6 μL金黄色葡萄球菌抗体偶联,300 μL金黄色葡萄球菌免疫磁珠在30 min内对104 CFU/mL金黄色葡萄球菌的捕获率为56.80%;建立的IMS-LAMP方法特异性高,对牛肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测灵敏度为1.2×103 CFU/mL,对金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为4.4×104 CFU/mL;富集5 h后,鼠伤寒沙门氏菌的检测限可至1.2 CFU/mL,富集7 h后,金黄色葡萄球菌的检测限可降至4.4 CFU/mL。建立的IMS-LAMP方法用时短,灵敏度高,操作简单,可以有效检测牛肉中的鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。