产ACE抑制肽菌株的筛选及其在模拟消化道环境中的活性分析

为了筛选出对血管紧张素转换酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）抑制活性较高并且具有较强的耐酸耐胆盐和耐盐的乳酸菌,对实验室保存的27株乳酸菌进行了产酸能力、蛋白水解活力、ACE抑制活性、模拟胃肠道消化及酸、胆盐和盐耐受性的测定。结果显示,菌株M3的ACE抑制率可达71.94%±1.39%,具有较好的蛋白水解活力和产酸能力,蛋白水解活力为（86.66±3.51）μg/mL亮氨酸,滴定酸度为（71.67±2.86）°T。菌株M3经人工胃肠液分别处理3 h后,ACE抑制率为74.96%±1.73%;在pH3的环境中3 h,耐受性为14.34%±1.21%,活菌数能达到7 lg CFU mL?1以上;在含有0.3%胆盐的培养基中3 h,耐受性为37.50%±2.47%;在含有4% NaCl的培养基中24 h,耐受性为37.32%±1.84%。该菌经16S rDNA鉴定为Lactobacillus (Lb.) paracasei subsp. paracasei M3。因此,菌株Lb. paracasei subsp. paracasei M3可用作发酵牛乳富产ACE抑制肽且能耐受消化道环境具有益生菌潜力的菌株。     

微生物发酵法制备大豆ACE抑制肽菌种的筛选

以大豆分离蛋白为底物,以血管紧张素转化酶(ACE)抑制率和肽含量为检测指标,选择5株乳酸菌、3株霉菌和1株枯草芽孢杆菌为出发菌种,通过微生物发酵筛选出具有高ACE抑制活性的发酵菌株。结果表明:乳酸菌中具有强ACE抑制活性的菌株为保加利亚乳杆菌,ACE抑制率和肽含量分别为57.93%和3.27mg/mL;霉菌中具有强ACE抑制活性的菌株为米曲霉,ACE抑制率和肽含量分别为41.23%和2.17mg/mL;枯草芽孢杆菌ACE抑制率和肽含量分别为45.02%和2.25mg/mL。综合比较9种菌株的发酵特性,选用保加利亚乳杆菌作为制备大豆抗高血压活性肽优良菌株。     

一株可提升豆酱风味乳酸菌的筛选、鉴定及应用

通过研究多菌种共同发酵豆酱,从豆酱产品中筛选理化指标优良、风味浓郁的特征性耐盐乳酸菌,并对该乳酸菌进行菌种鉴定及应用。结果表明,采用原位筛选法、平板复筛,得到一株可以显著抑制枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的乳酸菌,通过分子生物学技术该菌株被鉴定为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）。将筛选获得的乳酸片球菌（P. acidilactici）ZF559应用于豆酱发酵体系后,可以使其总酸含量降低7.7%,氨基酸态氮含量提升24%,使枯草芽孢杆菌（B. subtilis）的数量降低了94.55%,从而提升豆酱品质。     

贻贝盐溶蛋白特性分析及其ACE抑制肽的酶法制备

以贻贝为原料提取盐溶性蛋白,首先研究盐溶性蛋白的分子质量分布、粒度分布和变性温度等性质,然后比较其3?种蛋白酶（胰蛋白酶、中性蛋白酶和胰酶）酶解产物的血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制活性,筛选出ACE抑制活性较高的胰蛋白酶酶解物,其IC50值为215.96?μg/mL。利用质谱对胰蛋白酶酶解物中的多肽氨基酸序列进行鉴定,利用多肽序列与ACE的对接分数初步筛选出11?个分值大于180?分的多肽序列,通过氨基酸组成结合情况和两者间氢键等相互作用,进一步筛选活性肽并阐述抑制活性机理,最终推测出LYDIDVAK和WIAEEADK是活性较高的抑制肽。     

具有血管紧张素转换酶抑制活性的乳酸菌筛选及特性研究

血管紧张素转换酶（Angiotensin Converting Enzyme，ACE）是抗高血压药物的筛选靶位酶。以体外ACE抑制率为筛选指标，从传统发酵食品中筛选出12株具有ACE抑制活性的乳酸菌，研究了12株乳酸菌的ACE抑制活性和蛋白水解活性，以及模拟胃肠消化对乳酸菌发酵乳ACE抑制活性的影响和乳酸菌耐酸耐胆汁的特性。结果表明，CZ2112具有良好ACE抑制活性，经API鉴定系统鉴定为植物乳杆菌，ACE抑制类型为非竞争性抑制，24h发酵产物ACE抑制率可以达到83％，经模拟胃肠消化后抑制率为70％，邻苯二甲醛（OPA）法检测其蛋白水解活性为OPA指数0．43，对胃酸、胆汁具有较好的耐受性。     

腰果蛋白ACE抑制肽的分离纯化研究

以海南腰果为原料,通过碱溶酸沉法制备腰果蛋白,对其氨基酸的组成进行了分析,并通过酶解法制备腰果蛋白多肽,依次经过透析、柱层析分离纯化来研究腰果蛋白多肽的血管紧张素酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)抑制活性。实验结果表明,腰果蛋白中富含必需氨基酸与非必需氨基酸,是一种优质蛋白资源,腰果蛋白中疏水性氨基酸含量为20.4g/100g,有助于其ACE抑制活性。利用碱性蛋白酶进行酶解后制得的酶解液(1mg/mL)ACE抑制率为71.24%±5.96%,经过透析后所得小分子组分[(0～3500)u]的ACE抑制率(1 mg/mL)为85.01%±1.44%,经葡聚糖凝胶(Sephadex G-25)分离纯化后,得到6种组分,其中ACE抑制活性最高的组分为P4,1 mg/mL P4的ACE抑制率为90.01%±0.16%[IC_(50)为(36.25±0.12)μg/m L],将P4进行反向高效液相色谱进一步分离纯化后,得到3个组分,其中P4-3的ACE抑制活性最高,1 mg/mL P4-3的ACE抑制率为91.04%±0.31%[IC_(50)为(2.12±0.067)μg/mL],表现出较高的ACE抑制活性,腰果蛋白ACE抑制肽有望应用于高血压的预防与功能食品的开发,对腰果中蛋白资源的开发利用有一定的实验意义。     

酪蛋白水解物中ACE抑制肽分离及氨基酸序列分析

以牛乳酪蛋白为底物,先经胃蛋白酶水解,再经胰蛋白酶水解,从水解物中分离获得血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制肽并确定其氨基酸序列。酪蛋白的双酶水解物经超滤和葡聚糖凝胶色谱分离,分离得到3 个组分,收集高ACE活性抑制效果组分Ⅱ和Ⅲ。采用离子色谱法分析水解片段的氨基酸组成,液相色谱-质谱法分析水解片段的氨基酸序列,采用固相合成法制备获得的短肽片段,用分光光度法检测ACE活性抑制效果。结果表明,组分Ⅱ包含缬氨酸、丝氨酸、脯氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、酪氨酸,共8 种氨基酸,组分Ⅲ包含痕量的丝氨酸和酪氨酸;将组分Ⅱ和Ⅲ经液相色谱-质谱分析,获得8 个片段,其中,αs2-f（56～57）∶YS、αs2-f（98～107）∶YQKFPQYLQY和κ-f（52～61）∶INNQFLPYPY具有ACE活性抑制作用,其IC50值分别为11.89、11.75 μg/mL和421 μg/mL。     

具有高效ACE抑制活性乳酸菌的筛选及其益生特性研究

本研究运用紫外分光光度法初筛,再以HPLC法进行复筛,从31株源自云南传统发酵食品的乳酸菌中筛选具有高效ACE抑制活性菌株,同时研究其益生特性及脱脂乳发酵过程中ACE抑制率的动态变化。综合各项研究结果,最终筛选出ACE抑制率较高、抑菌谱广、耐酸耐胆盐性强,且对抗生素敏感的Lactobacillus plantarum YM-4-3作为研究菌株。益生特性研究表明,该菌株对Escherichia coli O 157:H 7和Listeria monocytogenes的抑菌圈直径可分别达41.30 mm和42.00 mm,甚至在高胆盐(0.3%)及强酸(p H 2.5)处理后仍保持较高活菌数(大于105 cfu数量级)。脱脂乳发酵过程中ACE抑制活性的动态监测表明,37℃发酵48 h是Lb.plantarum YM-4-3菌株发酵产生ACE抑制肽的最适培养条件,该发酵条件下获得的发酵乳的ACE抑制率可高达81.23%,菌体生物量、游离氨基酸及多肽含量也均达到最大值。本研究成果将为新型具有高效ACE抑制活性发酵乳制品的研发提供理论依据及菌株保证。     

产胞外多糖乳酸菌的筛选及抗氧化特性研究

以分离自贵州侗族、苗族传统发酵食品的36株乳酸菌为受试菌,筛选出8株高产胞外多糖（膜截留分子质量为8 000~14 000 u）的乳酸菌,分别为SR2-1（Pediococcus sp. F3S1）、SR2-2（Pediococcus pentosaceus NGRI 0304）、SR3-2（Pediococcus pentosaceus LB-WC）、SR8（Lactobacillus kimchi）、SR10-2（Pediococcus sp. 22-4）、SR12-1（Lactobacillus graminis）、H1（Staphylococcus sp. 3034O2）和XS2（Pediococcus pentosaceus GS17）,并对其胞外多糖进行体外抗氧化特性研究。结果显示,8株乳酸菌的胞外多糖均具有抗氧化活性,其中胞外多糖质量浓度为30 μg/mL时,乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖对Fe2+的清除率分别为15.55%、12.41%、53.21%;胞外多糖质量浓度为40 μg/mL时,乳酸菌SR2-2、SR8和SR12-1的胞外多糖对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）和NO2-的清除率分别达9.69%、11.93%、8.93%及5.73%、7.82%、3.82%。这三株乳酸菌显示出一定的抗氧化活性。     

乳酸菌中生物胺氧化酶菌株的筛选

为获得良好的具有生物胺降解能力的肉品发酵剂,本文以实验室前期筛选的63株乳酸菌作为研究对象,利用双层显色平板试验,氧化酶试验和高效液相色谱检测对产生物胺氧化酶菌进行筛选,并对所筛选的菌株做抑菌试验和耐盐耐亚硝酸盐等试验。结果表明:本次实验筛选出4株(1株Pediococcus acidilactici,1株Pediococcus pentosaceus,2株Lactobacillus plantarum)具有较强生物胺氧化能力的乳酸菌,其中以乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)的生物胺降解能力最好,其对苯乙胺、色胺、组胺、腐胺、尸胺、酪胺、亚精胺和精胺的降解率分别为56.71%、51.40%、40.86%、28.12%、18.92%、24.59%、18.20%和9.68%。通过抑菌试验和耐盐耐亚硝酸盐等试验发现乳酸片球菌对致病性大肠杆菌,单增李斯特菌,金黄色葡萄球菌具有良好抑菌效果,且耐盐能力在6%以上,耐亚硝酸盐能力在0.15 g/kg以上,最适温度为37℃,最适p H为6.5。     

响应面试验优化脆江蓠多糖提取工艺及其对肿瘤细胞的抑制作用

目的：研究脆江蓠多糖（Gracilaria chouae polysaccharides,GLP）的提取方法及其对肿瘤细胞生长的影响。方法：响应面法优化GLP提取工艺条件;四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测GLP对体外培养的人宫颈癌（HeLa）、食道癌（EC-109）、肝癌（HepG-2）以及乳腺癌（MCF-7）细胞生长的影响。结果：GLP最佳提取条件为预热温度93.1 ℃、料液比1∶61.5（g/mL）、超声时间35 min,在此条件下GLP提取率为16.75%。GLP在质量浓度200～1 000 μg/mL范围内对实验细胞均有抑制作用,且呈剂量依赖关系。当GLP质量浓度为1 000 μg/mL时,其对HeLa、HepG-2、MCF-7和EC-109细胞的抑制率分别为49.11%、41.18%、34.98%和31.33%。对HeLa细胞形态学观察以及Annexin V-FITC/PI荧光染色检测发现,随着GLP给药剂量的增加,凋亡和坏死细胞不断增多。结论：GLP对体外培养的人HeLa、EC-109、HepG-2以及MCF-7等癌细胞增殖有抑制作用,并能诱导肿瘤细胞凋亡。     

HPLC-PDA法测定明日叶不同部位中的4-羟基德里辛和黄色当归醇含量

采用高效液相色谱配备光电二极管阵列检测器法测定明日叶根、茎和叶中4 - 羟基德里辛（4-hydroxyderricin,4-HD）和黄色当归醇（xanthoangelol,XAG）的含量。样品分析选用Halo C18色谱柱（4.6 mm×150 mm,2.7 μm）,流动相为0.1%甲酸（A）-甲醇（B）溶液,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,检测波长为370 nm,柱温为40 ℃。4-HD、XAG在0.945～18.900、1.048～20.960 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好,样品含量的相对标准偏差分别为3.13%、2.52%,方法的重复性好,平均回收率分别为103.70%、103.05%。经检测明日叶中4-HD的分布规律为：茎（149.16 μg/g）＞根（122.42 μg/g）＞叶（1.24 μg/g）;XAG的分布规律为：根（144.28 μg/g）＞茎（75.17 μg/g）＞叶（1.21 μg/g）。4-HD和XAG在根和茎中的分布显著高于其在叶中的分布。     

不同干燥方法对乳源血管紧张素转化酶抑制肽活性的影响

用不同的干燥方法干燥富含血管紧张素转化酶（angiotensin converting enzyme,ACE）抑制肽的酪蛋白水解物,研究对ACE活性抑制的影响。在研究过程中,采用喷雾干燥法、流化床干燥法和真空冷冻干燥法干燥富含ACE抑制肽的酪蛋白水解产物,以干燥产物的水分含量低于5%为指标,确定干燥条件,以干燥产物的ACE活性半数抑制浓度（half inhibitory concentration,IC50）值,优化干燥条件。并通过动物实验,评价不同干燥方法所得产物的降血压效果。结果显示,采用喷雾干燥法干燥水解产物优化条件为：进风温度190 ℃、出风温度75 ℃、进料量44 mL/min,其干燥产物的ACE活性抑制的IC50值为0.442 mg/mL;流化床干燥水解物的条件为：进风温度65 ℃、进料量180 mL、悬浮介质添加量30 g,其干燥产物ACE活性抑制的IC50值为0.294 mg/mL;真空冷冻干燥产物的ACE活性抑制的IC50值为0.275 mg/mL。动物实验结果显示,采用真空冷冻干燥方法所得干燥产物,最有利于ACE抑制肽活性的保留,其次是流化床干燥,而喷雾干燥产物的活性损失最大。因此,在富含ACE抑制肽水解产物干燥时,采用冷冻干燥方法较好。     

大果榕果实乙醇提取物抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶抑制活性

研究大果榕果实的多酚含量及其抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶和乙酰胆碱酯酶抑制活性,为其进一步开发利用奠定基础。以采自海南保亭七仙岭的大果榕果实为实验材料,用体积分数65%的乙醇提取大果榕果实多酚,采用Folin-酚法测定总酚含量。对获得的大果榕果实多酚进行1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS)自由基、羟自由基(·OH)清除率以及α-葡萄糖苷酶抑制活性和乙酰胆碱酯酶抑制活性测定。结果表明:大果榕果实多酚含量较高,达1.92 mg/g(以干质量计),其对DPPH自由基、ABTS+·和·OH均具有显著的清除活性,且呈质量浓度依赖性,IC50值分别为141.25、91.20、45.71μg/m L;大果榕果实多酚对α-葡萄糖苷酶抑制活性强于阳性对照阿卡波糖,且呈现明显的质量浓度依赖性,IC50值为102.33μg/m L;同时大果榕果实多酚对乙酰胆碱酯酶也具有一定的抑制活性,IC50值为4.9 mg/m L。研究结果表明大果榕果实多酚具有良好的抗氧化性、α-葡萄糖苷酶抑制活性和一定的乙酰胆碱酯酶抑制活性。     

玉米环二肽（组氨酸-脯氨酸）的分离纯化、结构鉴定及其生物活性

环二肽（组氨酸-脯氨酸）（cyclo (His-Pro),CHP）是一种活性环二肽,在降血糖、抗氧化方面具有显著效果。实验通过DE-52阴离子交换层析、Sephadex G-25凝胶层析、半制备型高效液相色谱等方法,对高温高压环化后的玉米蛋白水解物进行分离纯化研究,得到CHP。采用超高效液相色谱、傅里叶变换红外光谱、核磁共振氢谱和碳谱对产物的结构进行鉴定,并通过体外降血糖和抗氧化实验初步测定了其生物活性。结果表明：采用本研究的分离纯化方法制备得到的CHP的纯度为97.36%,傅里叶变换红外光谱和核磁共振波谱的测定表明该肽的结构与预期结构相符,初步的生理活性鉴定结果表明,玉米CHP经分离纯化后对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性具有很强抑制能力,半抑制浓度（IC50）分别为1.1、1.9 mg/mL;且具有很强的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除活性（IC50 67 μg/mL）和还原力。     

UPLC-IDMS法测定配方奶粉中的生物素含量

建立一种超高效液相色谱-同位素稀释质谱法测定配方奶粉中生物素含量的方法。样品中加入生物素-D2作为同位素内标,经水超声提取后,以含体积分数0.1%甲酸的10 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱,采用电喷雾正离子模式、多反应监测方式进行定性定量分析。结果表明：生物素在1～50 ng/mL范围内线性关系良好,线性范围内对已知生物素含量样品3 个标准添加水平的平均回收率为89.6%～93.1%,相对标准偏差为1.71%～4.33%。方法检出限为0.6 μg/100 g,定量限为1.5 μg/100 g,该方法具有灵敏度高、重复性好、分析时间短等优点,可以满足配方奶粉中生物素含量的测定要求。     

利用DAD-HPLC和LC-MS法检测金丝小枣中黄酮类化合物

采用二极管阵列高效液相色谱分离技术和液相色谱-质谱联用技术对金丝小枣中黄酮类物质进行分析和鉴别。液相色谱条件为：色谱柱为Hypersil BDS-C18（250 mm×4.6 mm,5 μm）,柱温30 ℃,甲醇-0.1%甲酸溶液为流动相,梯度洗脱,流速0.8 mL/min,进样量10 μL,采用270 nm和370 nm双波长检测。结果表明：金丝小枣中含有杨梅素、芦丁、槲皮素、异鼠李素4 种黄酮类物质,含量分别为40.90、8.40、32.60 μg/g和12.56 μg/g。并且在5～125 μg/mL范围内,该方法显示良好的线性关系和重复性,当信噪比为3时,检出限为1.23～1.73 ng/L。精密度实验的相对标准偏差为1.10%～4.31%,加标回收率为93.50%～106.70%（相对标准偏差为0.68%～2.90%）。由此可以看出：该方法样品前处理简单、回收率较高、精密度良好,是一种便捷且精确的分析方法,适用于金丝小枣中黄酮类化合物的检测。     

聚氯乙烯类食品包装材料中三甲基锡向食品模拟物的迁移规律

目的：建立聚氯乙烯类包装材料和食品模拟物中三甲基锡的超高效液相色谱-串联质谱（ultra performanceliquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS）联用测定方法。用该方法研究聚氯乙烯中的三甲基锡向食品模拟物的迁移规律。方法：聚氯乙烯包装材料样品用乙酸乙酯提取。食品模拟物经阳离子固相萃取柱净化富集,洗脱液水浴条件下氮气吹干,残渣用流动相溶解,旋涡混匀,过0.22 μm微孔滤膜,经C18色谱柱完成分离,MS/MS仪上采用多反应监测正离子模式测定三甲基锡,外标法定量。在设定的不同温度条件下,将聚氯乙烯包装材料浸泡于食品模拟物中,于不同的时间点移取浸泡液,经前处理后测定三甲基锡迁移量。结果：三甲基锡在0.1～100.0 μg/L范围内线性关系良好（相关系数r=0.999 8）,检出限为0.02 μg/L。在1.0、10.0、50.0 μg/L 3 个添加水平范围内的平均回收率为90.6%～97.3%,相对标准偏差不高于6.9%。测定结果显示,三甲基锡迁移量在水模拟物中为0.19～1.65 μg/L、在体积分数10%乙醇模拟物中为0.19～9.89 μg/L、在3 g/100 mL乙酸模拟物中为0.11～9.96 μg/L、在正己烷模拟物中为0.15～3.54 μg/L。结论：建立的阳离子固相萃取-UPLC-MS/MS联用法测定食品模拟物中三甲基锡的方法快速简单、准确有效,三甲基锡在体积分数10%乙醇溶液和3 g/100 mL乙酸溶液迁移量较高,且随温度升高、时间延长,迁移量增加,一定时间后达到迁移平衡。     

预处理对胶原蛋白水解和血管紧张素转化酶抑制肽段释放的影响

以胰蛋白酶为工具酶,研究短时热处理、超高压处理对胶原蛋白水解和血管紧张素转化酶（angiotensinconverting enzyme,ACE）抑制肽段释放的影响。结果表明：热处理可显著促进胰蛋白酶对胶原蛋白的水解和ACE抑制活性肽段释放,超高压处理组水解物水解度（degree of hydrolysis,DH）与无处理组无显著差异,ACE抑制活性显著低于无处理组。水解物DH和ACE抑制活性关系研究显示,胰蛋白酶水解胶原蛋白过程中,水解度小于5%时,ACE抑制率随水解度呈明显上升趋势,水解度大于5%后,其上升趋势不再明显。肽谱分析进一步证明热处理可有效促进胶原蛋白的水解,超高压处理可改变胰蛋白酶作用位点。热处理组水解物序列分析显示,获得序列均来源于胶原蛋白三螺旋区域,且大部分序列都具有潜在的ACE抑制活性。说明短时热处理可以有效破坏胶原蛋白的三螺旋结构,促进ACE抑制肽段的释放。