HIV-1病毒样颗粒的纯化及其免疫原性

目的纯化HIV-1病毒样颗粒,并检测其免疫原性。方法稳定表达HIV-1结构蛋白Gag和Env的重组293细胞经大规模培养后,收集培养上清,经30%蔗糖垫两次纯化,免疫BALB/c小鼠,Western blot检测小鼠血清中抗体水平。结果重组293细胞培养上清的纯化产物经SDS-PAGE分析,可见目的蛋白的表达。Western blot检测显示,纯化蛋白具有良好的反应原性。免疫小鼠后能够诱导产生针对目的蛋白的抗体,其抗体水平呈剂量依赖关系。结论纯化的HIV-1病毒样颗粒能够诱导小鼠产生抗体,具有良好的免疫原性。     

重组人乳头瘤病毒33型L1病毒样颗粒的表达、纯化及免疫原性评价

目的利用毕赤酵母表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)33型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),评价其在小鼠体内的免疫原性。方法构建HPV33 L1表达质粒,电转化毕赤酵母,筛选高表达菌株,15 L发酵罐发酵,离子交换和凝胶体积排阻层析分离纯化HPV33 L1 VLPs,纯化后样品免疫小鼠,采用假病毒中和试验检测小鼠免疫后血清中和抗体滴度。结果质粒HPV33 L1-pPIC3. 5K经双酶切及测序鉴定证明构建成功;毕赤酵母表达产物经Western blot分析,可见相对分子质量约56 000的目的条带;透射电镜下可见直径约60 nm的病毒样颗粒;纯化后的HPV33 L1 VLPs纯度可达95%以上;0. 4和0. 04μg HPV33 L1 VLPs免疫后小鼠血清中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为3 200和566,差异有统计学意义(P 0. 05)。结论利用毕赤酵母成功表达了HPV33 L1 VLPs,并具有良好的免疫原性。     

诺如病毒衣壳蛋白在293T细胞中的表达及纯化

目的在293T细胞中表达诺如病毒衣壳蛋白,并进行纯化。方法将合成的人诺如病毒GII.4悉尼大流行株VP1基因(全长1 623 bp)插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达质粒,测序验证无误后,通过磷酸钙共沉淀法将质粒转染至293T细胞中,收获转染细胞上清,进行Western blot鉴定。转染3~5 d后,收获细胞上清,经氯化铯平衡密度梯度离心纯化衣壳蛋白,收集各组分,离心沉淀病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),PBS重悬后,SDS-PAGE分析目的蛋白的纯度;电镜观察VLPs;BCA法测定蛋白含量。结果 Western blot分析显示,重组表达质粒转染的293T细胞上清可见特异的蛋白条带。收获的细胞培养上清经氯化铯平衡密度梯度离心后,可见3个明显条带;10%SDS-PAGE分析显示,衣壳蛋白主要位于第3个条带,纯度达95%以上;目的蛋白有2个条带,相对分子质量分别为59 000和56 000;收集的3个组分经电镜观察可见,表达的诺如病毒衣壳蛋白主要位于第3个条带,且组装成了VLPs,颗粒大小约为38 nm;每升培养基可获得约500μg VLPs。结论成功在293T细胞中表达了诺如病毒衣壳蛋白,该衣壳蛋白成功组装成了VLPs。本实验建立了一种小规模制备诺如病毒VLPs的新方法。     

人乳头瘤病毒31型L1病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达及其免疫原性初步评价

目的在毕赤酵母中表达人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)31型L1病毒样颗粒(virus-like particles,VLP),并初步评价其免疫原性。方法构建HPV31 L1四拷贝重组表达质粒,电转化毕赤酵母KM71,甲醇诱导表达蛋白。将重组菌经30 L发酵罐发酵,产物分离纯化,用纯化样品免疫小鼠,采用半数有效剂量(median effective dose,ED50)初步评价表达产物的免疫原性。结果经双酶切鉴定,四拷贝重组表达质粒构建正确。表达产物可与小鼠抗HPV L1单抗发生特异性结合。纯化产物在透射电镜下为直径60 nm的VLP结构,相对分子质量约55 000,纯度达95%以上。小鼠体内效价ED50值为0. 018μg。结论成功在毕赤酵母中表达了HPV31型L1 VLP,其在小鼠体内具有良好的免疫原性。     

口蹄疫病毒病毒样颗粒疫苗的研究进展

口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由 口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的一种烈性传染病,主要感染牛、猪、绵羊、山羊等偶蹄动物,我国将其列为一类传染病,注射疫苗是控制该疾病的有效措施.病毒样颗粒(virus-like particles,V...     

轮状病毒病毒样颗粒疫苗的研究进展

轮状病毒(rotavirus,RV)是全球范围内导致5岁以下婴幼儿严重腹泻的主要病原体,造成了巨大的经济和社会负担。目前,疫苗预防接种是控制RV感染最有效的手段,但目前已上市RV疫苗的有效性较低,且会增加肠套叠的风险。病毒样颗粒(VLP)在构象上与亲本病毒相似,具有高度免疫原性,且不存在毒力回复突变等风险。RV-VLP疫苗不仅能够刺激细胞和体液免疫反应,而且能提供更好的血清型覆盖。因此,RV-VLP疫苗作为下一代候选疫苗具有巨大的潜力。     

人乳头瘤病毒18型病毒样颗粒的特征分析

目的对人乳头瘤病毒18型(human papilloma virus 18,HPV18)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)进行特征分析。方法采用质谱技术分析HPV18 VLPs(重组大肠埃希菌表达系统表达L1蛋白,自组装成为VLPs)蛋白质一级结构,圆二色谱技术分析蛋白质二级结构,高效液相色谱、透射电镜和动态光散射技术分析蛋白质三级和四级结构;同时采用假病毒中和试验分析HPV18 VLPs的免疫原性,SDS-PAGE法分析样品纯度。结果HPV18 VLPs蛋白翻译后修饰主要包括氧化和去酰胺化,完整L1单体分子量约56 000;二级结构中螺旋、折叠、转角、不规则卷曲的比例分别为8. 4%、46. 1%、18. 5%、30. 2%;颗粒纯度达99%以上,且形态饱满完整,大小均一,直径约60 nm。HPV18 VLPs诱导小鼠产生中和抗体滴度的几何均值达3 000以上。HPV18 VLPs中完整L1单体含量达95%以上。结论 HPV18 VLPs结构完整,颗粒大小均一,纯度高,免疫原性良好,本研究为宫颈癌疫苗安全性和有效性的评价奠定了基础。     

人乳头瘤病毒52型L1蛋白病毒样颗粒在毕赤酵母中的优化表达、纯化及其免疫原性

目的利用毕赤酵母系统表达人乳头瘤病毒52型(human papillomaviruses 52,HPV52)L1蛋白,并检测其病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的免疫原性。方法采用同义密码子替换的方法对HPV52 L1蛋白的野生型基因进行密码子优化,并在体外构建多拷贝表达质粒,经转化和筛选获得在毕赤酵母系统中高表达的HPV52 L1 VLP菌种。采用15 L发酵罐大规模培养,菌液破碎上清经阳离子交换层析和分子筛排阻层析两步法纯化,获得HPV52 L1VLP。动态光散射和透射电子显微镜观察HPV52 L1 VLP的大小和形态,假病毒中和试验检测HPV52 L1 VLP在小鼠及大鼠体内的免疫原性。结果 HPV52 L1 VLP在溶液中呈较均一的单一组分,水合粒径为91. 37 nm;镜下观察呈均一的、直径约50 nm的球状空心颗粒,大小与HPV52天然病毒颗粒相近。HPV52 L1 VLP相对分子质量约56 000,纯度达95%以上,产量为3. 6 mg/L,且可与小鼠抗HPV L1多克隆单抗发生特异性结合。HPV52 L1 VLP在小鼠体内的半数有效剂量(ED_(50))为0. 010μg,在大鼠体内诱导产生的中和抗体滴度高达106。结论于毕赤酵母系统成功表达了HPV52 L1 VLP,且具有良好的免疫原性,为相关预防性疫苗的研发奠定了基础。     

病毒样颗粒疫苗及载体的研究进展

病毒样颗粒(VLPs)是由病毒衣壳蛋白结构抗原自行装配而成的类似病毒粒子的完整结构,因此保持了病毒抗原蛋白的天然构象。VLPs在疫苗和呈递系统方面受到广泛关注。本文就VLPs疫苗及VLPs载体的研究进展作一综述。     

HPV 16 L1天然变异体在毕赤酵母中的可溶性表达及病毒样颗粒装配

目的在毕赤酵母中表达两个临床人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16型毒株主要衣壳蛋白L1(HPV 16 L1),并分析表达产物的可溶性及病毒样颗粒(virus-like parcticle,VLP)装配差异。方法将编码两个不同HPV 16毒株L1蛋白的全长基因序列M16和Y16分别重组于毕赤酵母表达载体p Pink LC,构建重组表达质粒Y16LC和M16LC,转化表达菌株p Pink strain 1。重组菌经甲醇诱导后,Western blot分析L1蛋白的表达水平及可溶性。经密度梯度离心结合透射电镜观察,分析VLP装配情况。通过软件pubmed在线Alignment分析两个序列的氨基酸排列。结果两个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证明构建正确。两个序列获得了相似的蛋白表达水平,但Y16的可溶性较差,几乎且无VLP形成;而M16呈现较好的蛋白可溶性及VLP装配能力。Y16与M16有5个氨基酸的差异(H202D、T266A、Δ424S、D441Δ、K452Q)。结论 HPV 16 L1氨基酸的微小改变尽管未对重组蛋白的表达水平产生影响,但显著影响有功能的预期产物的获得。提示在基因重组病毒疫苗研发中,制备VLP时需考虑毒株的选择,甚至主动进行抗原的特定氨基酸的改造。     

人乳头瘤病毒16型L1蛋白VLP的原核表达及纯化

目的在大肠杆菌中表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1蛋白病毒样颗粒(VLP),并进行纯化,为研制宫颈癌疫苗提供新的思路。方法以HPV16基因组DNA为模板,PCR扩增HPV16L1基因的编码区,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)编码区下游,构建重组表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用GST纯化柱纯化重组融合蛋白,并用凝血酶切去GST标签,再经S100分子筛纯化,浓缩后,电镜观察纯化蛋白的VLP形态。结果重组表达质粒经双酶切和测序,证明构建正确。表达产物的相对分子质量约为80000,主要以可溶性形式存在。Western blot显示,目的蛋白可与小鼠抗HPV16L1抗体发生特异性反应。纯化蛋白的纯度约为95%,在电镜下可见直径约为50～60nm的VLP。结论已成功地在大肠杆菌中表达了可溶性的HPV16L1蛋白VLP,并进行了纯化,为宫颈癌疫苗及血清学诊断试剂的研制奠定了基础。     

HIV-1 DNA疫苗的构建及免疫原性

目的构建稳定表达HIV-1Gag-Pol蛋白的DNA疫苗,提高目的基因的表达效率。方法对HIV-1野生型Gag-Pol基因序列进行优化,使用本室构建的表达载体VR,构建重组质粒VR-GPCINS。将构建的重组质粒VR-GPCINS转染HEK293细胞,Western blot鉴定表达产物。用构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,Western blot检测体液免疫反应。结果成功构建能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的VR-GPCINS质粒,Western blot在免疫小鼠的血清中检测到抗p24的特异性抗体。结论含优化Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GPCINS在细胞表达和体液免疫方面均明显优于含野生型Gag-Pol基因序列的质粒DNA疫苗VR-GP。     

中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选

目的获得高质量的中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白抗原。方法改造表达载体,以构建中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白基因带有筛选标记的真核细胞表达质粒,将所构建质粒转染真核细胞,用含有抗性的培养基筛选出能够高效、持续表达包膜蛋白的稳定表达细胞株。结果所构建的表达载体pVRPEnv转染细胞后可表达目的蛋白,并建立了稳定表达细胞系。结论获得了可以高效、持续稳定表达中国流行株HIV-1B/C重组亚型包膜蛋白的细胞株。     

DNA表达载体构建及HIV多表位核酸疫苗的设计与表达

目的利用塞姆利基森林病毒(SFV)复制子构建新型真核表达载体,并对含HIV-1中国流行株B亚型核心蛋白p24及多表位MEG嵌合基因的核酸疫苗进行表达与鉴定。方法将含SFV复制子的元件从pSFV-MCS中切下,连入含CMV启动子及增强子的pIRESneo载体中,构建新型真核表达载体pCS,再将含HIV-1 MEGp24基因插入至pCS载体中,构建重组核酸疫苗pCS-MEGp24。用脂质体法将重组质粒转染入BHK-21细胞,进行表达产物的检测。结果间接免疫荧光检测显示,重组质粒转染的BHK-21细胞能有效表达HIV-1 MEGp24,并与HIV阳性血清反应。结论所构建的核酸疫苗可在BHK-21细胞系内进行表达,且MEGp24基因的表达蛋白具有特异性,为构建新型HIV-1中国流行株核酸疫苗的可行性提供了重要实验依据。     

表达HIV-1 Gag-Pol抗原的重组痘病毒的构建及免疫原性

目的构建稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体疫苗,并检测其体液免疫效果。方法将修饰型HIV-1Gag-Pol基因插入到痘病毒表达载体pSC11m2启动子P7·5下游,经与野生型痘病毒同源重组后,进行蓝白斑筛选。用筛选得到的重组病毒rM-GP转染HEK293细胞,经SDS-PAGE和Westernblot检测表达蛋白。用该重组病毒免疫BALB/c小鼠,并检测体液免疫应答。结果已筛选到稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白的重组痘病毒载体rM-GP,经Westernblot,在免疫小鼠血清中检测到抗HIV-1p24蛋白的特异性抗体。结论重组痘病毒载体rM-GP能稳定高效表达HIV-1Gag-Pol蛋白,并能引起有效的体液免疫应答。     

重组戊型肝炎病毒抗原ELISA检测方法的建立

目的建立重组戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,用于HE疫苗中HEV抗原含量的检测。方法以重组HEV病毒样颗粒作为免疫原,免疫母鸡,制备抗HEV-IgY多克隆抗体,纯化后作为包被抗体,HRP标记的抗HEV单克隆抗体作为检测抗体,建立HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,并对其进行验证。用建立的方法检测3批HE疫苗成品的HEV抗原含量,计算HEV抗原对氢氧化铝的吸附率。结果建立的ELISA方法线性范围为2～128 ng/ml,最低定量限为2 ng/ml;该方法检测冻干甲肝减毒活疫苗、重组人白介素-2(IL-2)、乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、人血白蛋白、小牛血清及健康人血清均无交叉反应;该方法检测3个浓度的HEV抗原内部参考品的回收率在95.13%～104.50%之间,试验内及试验间变异系数均<15%;包被抗HEV-IgY的酶标板于37℃放置5 d,其检测HEV抗原内部参考品的A450值及敏感性均未发生显著变化;3批HE疫苗成品中HEV抗原对氢氧化铝的吸附率均大于95%,符合相关质控要求。结论已成功建立了HEV抗原双抗体夹心ELISA定量检测方法,可用于HEV抗原含量的检测。     

Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白的表达及纯化

目的获得高纯度的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。方法以Vif/VR1012质粒为模板,PCR扩增出Vif-ΔN28基因并插入pRSETB质粒。将构建的原核表达载体Vif-ΔN28/pRSETB以及已有的Cullin5-N138/pRSETB质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA离子纯化柱纯化、复性。结果所表达的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白约占各自菌体总蛋白的20%,纯化后蛋白纯度均可达90%以上。结论已成功构建了Vif-ΔN28原核表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达,获得了可溶性的纯化的Vif-ΔN28和Cullin5-N138蛋白。     

HIV抗体确认试剂国家参考品的建立

目的建立评价HIV抗体确认试剂的国家参考品。方法从我国部分地区收集HIV感染者或可疑感染者以及非HIV感染者血浆样品,并对其进行HIV抗体、核酸以及抗体条带等检测,从中筛选出有代表性的样品组成参考品,用4家不同的HIV抗体确认试剂进行检测和标化。结果共筛选出27份样品组成HIV抗体确认试剂参考品,其中10份为HIV抗体确认阳性参考品,12份为HIV抗体确认阴性参考品,5份为HIV抗体不确定参考品。用4家不同的HIV抗体确认试剂标化12次,10份HIV抗体确认阳性参考品均检测为确认阳性;5份不确定参考品均检测为确认阳性或不确定,无检测为阴性者;12份阴性参考品10次均检测为确认阴性。结论该参考品可用于评价HIV抗体确证试剂的质量。     

HIV-1 Vif基因的克隆与原核表达

目的克隆HIV-1Vif基因编码区序列,并在原核细胞中表达。方法构建原核表达载体pMRI,将Vif基因序列克隆至该载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,菌体裂解后获得特异性表达蛋白,用组氨酸标签特异性亲和树脂分离纯化该蛋白,并经SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果表达质粒pMRI-Vif经双酶切,可见约600bp的Vif基因片段,测序结果证明质粒构建正确。在大肠杆菌BL21(DE3)中高效表达了可溶性Vif蛋白,纯化后经凝胶自动扫描分析,纯度达85%以上,蛋白浓度约为1g/L。纯化产物具有良好的抗原特异性。结论在大肠杆菌中高效表达了可溶性Vif蛋白。