莱茵衣藻硫胁迫相关microRNA检测及其靶基因分析

采用特异反转录引物,构建莱茵衣藻microRNA(miRNA)的cDNA文库.选用U4核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)作为内参,用SYBR(R)green RT-PCR对3种与莱茵衣藻缺硫胁迫反应相关的miRNA进行检测,利用在线平台软件Web MicroRNAs Designer(WMD3)对miRNA靶基因进行预测.结果表明,在缺硫胁迫下,3种miRNA(miRNA1145.2、miRNA1146和miRNA1158)的表达水平均明显上调,与正常培养的莱茵衣藻表达miRNA的相对丰度比值分别为3.11、2.38和3.67.靶基因预测分析表明,miRNA1145.2能影响脂肪酸氧化反应,miRNA1146与辅酶Q代谢相关,miRNA1158可能参与磷酸戊糖途径调控.     

拟南芥microRNA通路中新因子的筛选和突变体分析

小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)是一类长度为20~24核苷酸(nucleotide,nt)的非编码的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA),在植物生长发育过程中具有重要作用.为鉴定参与植物miRNA合成、降解和运输等通路的因子,利用拟南芥转基因株系SUC2:amiR-SUL进行正向遗传筛选体系,通过对该株系进行甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)诱变筛选获得SUP-E45突变体.对该突变体进行表型观察、实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和全基因组测序实验.结果显示,突变的基因为Ago1(Argonaute 1),该基因编码的AGO1蛋白是miRNA通路中至关重要的蛋白,成熟的miRNA与AGO1蛋白结合形成miRISC沉默复合体(miRNA-induced silencing complex,miRISC)从而对靶基因的表达进行负调控.验证了该筛选体系的可行性.通过该筛选体系可筛选出其他参与miRNA合成、影响miRNA活性或miRNA运输等通路的因子,为后续拟南芥miRNA通路的研究奠定了基础.     

莱茵衣藻CrDRBs基因的克隆和生物信息学分析

双链核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)结合蛋白(double-stranded RNA-binding protein,DRB)是一类含有双链RNA结合结构域(dsRBD)的蛋白,在小核糖核酸(micro ribonucleic acid,microRNA或miRNA)的生物合成和作用方式选择方面起着重要作用.为获得莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C. reinhardtii)中所有CrDRBs的全长序列并进行生物信息学分析,从蛋白质功能结构域Pfam数据库中下载了dsRBD结构域模块,使用HMMER软件基于dsRBD检索C. reinhardtii全基因组序列,获得C. reinhardtii中4个含dsRBD结构域的CrDRB蛋白相关信息.抽提C. reinhardtii总RNA,反转录获得其cDNA,设计相应引物克隆获得其完整的基因ORF序列.设计实时荧光定量PCR引物,以actin基因为内参,分析C. reinhardtii各CrDRBs基因的相对表达.同源比对分析C. reinhardtii各CrDRBs蛋白的dsRBD序列.通过Phyre2软件在线预测其dsRBD的高级结构.将莱茵衣藻CrDRBs的dsRBD与拟南芥的5个DRB成员构建系统进化树分析,初步探讨分析莱茵衣藻CrDRBs各成员的的进化保守性.本研究共获得了4个莱茵衣藻双链RNA结合蛋白,均具有典型的dsRBD结构域,含有3个保守氨基酸.相比已报道的DUS16,其他3个CrDRBs的CDS序列较长,基因表达较高(除CrDRB2外).本研究为下一步揭示莱茵衣藻CrDRB在miRNA调控途径的功能奠定基础.     

基于高通量数据的人体外源性植物miRNA跨界调控建模

以基于人体血清的高通量测序数据为研究对象,采用生物计算方法对数据进行分析,以目前已知的人类和植物的RNA数据作为参照集,从中筛选出可能的人体外源植物miRNA;基于miRNA的调控机制原理,获得可能的植物miRNA干扰人类mRNA的靶基因;构建植物miRNA-人类mRNA调控网络模型,分析可能的跨界调控作用。本文通过构建植物-人体跨界调控模型,共挖掘出9个核心模块。研究结果表明,外源性植物miRNA参与调控人体胺代谢、酒精代谢以及脂肪酸代谢等生物过程。     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区(命名为Kago2),构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm(spl)-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

家蚕Argonaute2的表达分析及其结合RNA的初步研究

从家蚕cDNA文库中扩增到家蚕BmAGO2基因完整的ORF序列,通过Lasergene软件分析获得BmAGO2的抗原表位区（命名为Kago2）,构建含Kago2的表达载体,转化大肠杆菌诱导表达,融合蛋白经镍柱亲和层析纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA和Western blotting检测抗血清的效价可达到1∶25 600以上,抗体特异性较好。表达谱分析结果显示,BmAGO2蛋白在家蚕卵期、蛹期、蛾期和五龄幼虫期均表达,但在蛹期表达量要偏低。而在五龄幼虫各组织中BmAGO2蛋白的表达差异较明显,BmAGO2蛋白在头部和表皮中大量表达,丝腺、马氏管和脂肪中也有少量表达,而在血淋巴、气管和中肠中未检测到该蛋白的表达。结合BmAGO2表达谱分析结果,进一步利用其抗体通过免疫共沉淀方法从BmAGO2蛋白表达量高的家蚕头部和表皮中分离出BmAGO2蛋白及结合的RNA,并逆转录成cDNA。以家蚕miRNA潜在的靶基因Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmmβ2作为检测基因,荧光定量PCR分析获得的BmAGO2结合RNA,和对照组RNA相比,Bmem4,Bm（spl）-like,Bmemc,Bmmγ,Bmβ2基因在BmAGO2结合RNA中的含量分别富集了3.93、1.31、2.4、1.31、0.97倍。miRNA靶位点分析表明,Bmem4和Bmemc存在多个miRNA结合位点,极有可能是miRNA的靶基因。目前还没有有效的家蚕miRNA靶基因高通量鉴定方法,本实验为家蚕miRNA靶基因的高通量筛选提提供了可靠地实验途径。     

乳腺癌中SRA1基因表达调控的生物信息学分析

分析类固醇受体RNA激活物(steroid receptor RNA activator,SRA1)以长链非编码RNA形式(lncRNA SRA1)和蛋白质形式(SRA1蛋白)在乳腺癌中的分子调控网络。运用RegRNA、Targetscan、MicroCosm Targets、PicTar软件和HMDD、DAVID在线数据库,预测lncRNA SRA1与microRNA及下游靶基因间的多种调控途径,对靶基因进行功能富集分析,绘制lncRNA SRA1的核心调控网络图。同时运用TCGA数据库、string软件预测分析与SRA1蛋白相互作用的蛋白质。发现lncRNA SRA1上存在hsa-let-7b、hsa-let-7c、hsa-let-7g、hsa-let-7i、has-miR-92、has-miR-103、has-miR-194、has-miR-874、has-miR-141、has-miR-146a、has-miR-661这11个与乳腺癌相关microRNA的可能结合位点,从而调节下游230个靶基因,构建了lncRNA SRA1-miRNAs-mRNAs调控网络,提示lncRNA SRA1可能参与基因转录调控、生物合成、MAPK、癌症相关通路、紧密连接等信号通路。并且发现SRA1蛋白和DDX17、ESR1、NCOA2、NCOA1、NRIP1等多种蛋白存在相互作用。对SRA1基因调控网络的生物信息学分析有助于理解其在乳腺癌发生发展过程中的分子机制。     

糖尿病鼠骨骼肌萎缩相关环状RNA的研究

骨骼肌萎缩是糖尿病患者中、晚期严重并发症之一,为研究其分子发病机制,利用链脲佐菌素诱导构建小鼠1型糖尿病模型,通过高通量测序技术,调查与糖尿病肌萎缩病变相关的环状核糖核酸（circular ribonucleic acid,circRNA）表达谱,并利用生物信息分析软件探究circRNA在糖尿病骨骼肌萎缩病变中的可能作用．结果显示,与正常同基因背景小鼠的同类组织相比,糖尿病鼠的腓肠肌呈现：(1)肌纤维面积明显减小,运动功能下降;(2)含有1 403个与1型糖尿病发生发展相关的差异表达circRNA,其中,690个上调和713个下调;(3)通过基因本体、京都基因和基因组百科全书的功能富集分析显示,差异表达的候选circRNA亲本基因主要富集于转录调节生物学过程、细胞质成分和蛋白质结合分子功能等方面,以及促分裂原活化蛋白激酶信号通路、泛素介导的蛋白降解、叉头盒蛋白O通路与糖尿病肌萎缩相关的信号通路等．通过数据库信息和生物信息分析技术,预测与肌萎缩基因MuRF1相结合的小RNA(mirco RNA,miRNA),并挖掘出可调控它们表达的功能circRNA,构建了circRNA-miRNA-m...     

基于全基因组De novo测序的异常汉逊酵母菌株792基因组重复序列的分布特征研究

重复序列是基因组的重要组成部分,对生物的进化、遗传和基因的表达调控有重要作用.本研究利用生物信息学方法,在异常汉逊酵母菌株792全基因组de novo测序的基础上,对基因组重复序列的分布特征进行了研究.结果表明,其全基因组中重复序列总长346 417bp,其中,串联重复序列238 164bp,散在重复序列108 253bp,占基因组长度的2.52%,平均每4.05Kb就有一个重复序列.微卫星DNA序列中重复单元拷贝数大多低于15次,其优势碱基类型为三核苷酸重复,重复单元基序为AAC的微卫星序列数目最多;小卫星DNA序列重复单元拷贝数小于微卫星DNA,主要分布1~3次,重复单元大于15bp的小卫星序列数目随着重复单位长度的增加呈下降趋势.散在重复序列中长末端重复序列(LTR)数目最多,滚环(RC)平均长度最长.本研究结果为汉逊酵母菌的分子定向育种和SSR分子标记的开发提供理论基础.     

晚期垃圾渗滤液MBR亚硝化系统中细菌及功能菌的多样性

为了处理晚期垃圾渗滤液,利用膜生物反应器(membrane bioreactor,MBR)实现了稳定亚硝化.分别构建总细菌通用克隆文库和针对亚硝化功能菌氨氧化菌(ammonia oxidizing bacteria,AOB)的功能基因——amo A基因的克隆文库,来研究稳定期亚硝化系统中微生物多样性.从16S r DNA克隆文库中随机挑选82个阳性克隆子进行序列测定,将测序结果与Genbank中已有模式菌株的序列进行比对后发现,亚硝化系统中主要有4个优势菌群,分别是Proteobacteria类群(64.65%)、未培养菌(uncultured bacterium)类群(18.3%)、Bacteroidetes类群(9.76%)、Firmicutes类群(7.32%).构建针对AOB的amo A功能基因的克隆文库,从文库中挑选73个阳性克隆子进行序列测定,经序列比对后发现在系统中仅检测到了亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)和未培养菌,分别占41.1%和58.9%.这表明系统中起到亚硝化作用的微生物种群主要是亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas).此外,未培养细菌的大量存在表明,系统中还存在着丰富的微生物资源等待进一步的开发利用.     

家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达

从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30 kDa载脂蛋白19G1前体 (low molecular mass 30 kDa lipoprotein 19G1 precursor)的EST序列(GeneBank登录号: AY568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771 bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5 kDa ,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽.根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到pET-28a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,裂解菌作SDS-PAGE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础.     

莱茵衣藻响应缺硫的环状RNA的预测与鉴定

环状核糖核酸(circular ribonucleic acid,circular RNA或circRNA)是一类无5'帽子结构及3'poly A尾,以共价键连接形成闭合环形结构的非编码RNA分子,通过转录后调控的方式参与动植物细胞的众多代谢途径.莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii,C. reinhardtii)是一种重要的真核单细胞模式微藻,为探究其是否存在环状RNA,本研究通过RNA-Seq高通量测序分析正常与缺硫培养的C. reinhardtii RNA组学数据,首次预测获得218条环状RNA序列,通过对比缺硫处理前后莱茵衣藻环状RNA序列,获得8条差异表达的环状RNA序列(其中,5条为表达上调、3条为表达下调).本研究首次对单细胞真核微藻莱茵衣藻进行环状RNA的生物信息学预测,确认莱茵衣藻环状RNA响应缺硫胁迫,为下一步揭示莱茵衣藻环状RNA参与响应莱茵衣藻缺硫的作用机制奠定基础.     

乙肝病毒编码miRNA的预测及鉴定

为探究乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是否能够编码microRNA(miRNA),与宿主mRNA靶向结合来参与病毒感染的调控机制,实验通过Vir-Mir数据库预测乙肝病毒编码的pre-miRNA,并结合miRNA测序和实时荧光定量PCR方法验证成熟体miRNA。结果显示:乙肝病毒DNA阳性的肝癌血清样本中存在六条premiRNA,并成功验证其中一条成熟体命名为hbv-miR-15467,为肝病治疗提供新的思路。     

miRNA与恶性肿瘤关系研究进展

miRNA(microRNA或miRNA),是一类长度约22nt的内源性短链非编码小分子RNA,通常在转录后水平调控基因表达,在RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)下靶向结合mRNA,进而降解RNA或阻遏转录后翻译功能。近年研究,miRNA参与细胞的分化、发育、增殖、死亡等生命活动中的一系列重要进程,在肿瘤发生中可能是潜在的抑癌或致癌基因。本文就miRNA在肿瘤中基因表达、肿瘤疾病的预防和治疗做一综述。     

功能与疾病中的RBFox蛋白家族

RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)是细胞内一类能与单链或双链核糖核酸(ribonuleic acid,RNA)结合并形成核糖核蛋白复合体的一类蛋白.RBFox (RNA binding proteins feminine gene on X chromosome)蛋白是RNA结合蛋白家族中的重要成员,在多种动物体内的特定组织细胞中表达并发挥生物学功能.已发现的RBFox蛋白包括RBFox1、RBFox2和RBFox3,均含有进化上高度保守的RNA识别结构基序(RNA recognition motif,RRM),能特异性地与(U) GCAUG序列结合并发挥作用.目前研究揭示了RBFox蛋白是一类多功能蛋白,除了调控RNA加工过程中的经典功能可变剪接之外,还广泛参与基因转录、mRNA稳定性调节、miRNA代谢以及蛋白翻译等过程,在心脏疾病、神经系统疾病、糖尿病和癌症等疾病的发生发展过程中起重要调控作用.本文概述了目前RBFox家族在调节剪接、转录、miRNA代谢和mRNA稳定性的4个功能及其在心脏疾病、神经系统疾病、糖尿病和癌症等多种疾病方面的研究进展,为RBFox蛋白的作用机制及其对疾病调控的进一步研究提供借鉴.     

拟南芥ago1-27突变体的RNA-seq分析

miRNA在植物生长发育和环境适应等方面起着极为重要的作用.本研究对拟南芥ago1-27突变体进行了RNA-seq,鉴定到几千个差异表达基因,并且miRNA靶基因倾向于在ago1-27中表达上调.ago1-27 RNA-seq结合降解组分析鉴定到新的miRNA靶基因,如miR396靶向半胱氨酸蛋白酶基因和miR167靶向编码AT-hook DNA结合蛋白的基因等.     

肠炎沙门氏菌血清型特异性基因挖掘及生物信息学分析

肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Enteritidis)能引起畜禽的胃肠炎以及食物中毒,其血清型鉴定较为复杂.为了挖掘肠炎沙门氏菌血清型特异性基因,以44个已测序沙门氏菌基因组构建数据库,利用肠炎沙门氏菌所有蛋白编码序列为查询序列,通过BLASTN比对,挖掘出6个肠炎沙门氏菌血清型特异性基因(SEN1382,SEN1383,SEN1388,SEN1936,SEN1945和SEN1959),其中4个基因编码噬菌体相关蛋白.同时,研究分析了肠炎沙门氏菌血清型特异性基因的理化性质、二级结构、三级结构、亚细胞定位、信号肽和跨膜区等特征,结果表明肠炎沙门氏菌血清型特异性基因具有多样性特征.挖掘的血清型特异性基因可为鉴定肠炎沙门氏菌提供检测靶标.     

家蚕znfhit基因的克隆表达及序列分析

在对家蚕蛹 cDNA文库的测序中发现了znfhit(zinc finger HIT)的 EST序列(GenBank登录号 DY230769).经过比对发现znfhit全长为1019bp,由297bp的 5'端非编码区序列(5'UTR)、462bp的开放读码框(ORF)和260bp的3'端非编码区序列(3'UTR)组成.将该基因的cDNA和家蚕基因组序列比对,此基因由3个外显子和2个内含子组成.ZNFHIT蛋白的疏水性最大值为1.533,最小值为-3.267,且不含跨膜区域.用PCR方法扩增获得znfhit基因,将其克隆至质粒pET-28a上,构建重组质粒pET-znfhit,并在大肠杆菌中大量表达,经镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白,质谱鉴定其分子量为21.11KD,为后续研究其功能提供了条件.     

调控流感病毒基因片段的人编码microRNA的新方法

提出了基于流感病毒片段保守区的microRNA(简写为miR-CR)方法来寻找调控流感病毒的人编码miRNA。以H1N1流感病毒的HA、NA、NP、PB2、PA片段为例,最终得到7条能够调控以上5个片段的人编码miRNA,结果有待于进一步实验验证。本文的研究结果对于找出流感病毒致病性与传染性的变化规律以及流感病毒的靶基因药物设计具有重要意义。     

细胞质处理小体(P-小体)与基因表达的调控

m RNA处理小体,又称P-小体(processing bodies,P-bodies),是细胞质中含有多种功能蛋白和RNA的聚集体.评述P-小体的形成和运动特点,以及其与小RNA、外切体相互作用,参与基因表达的调控.介绍了本实验室在P-小体植物细胞中的最新研究进展.指出P-小体是m RNA降解和储存的场所,在转录后水平参与基因表达的调控,P-小体在细胞中是动态变化的,P-小体中多样化的功能蛋白在P-小体的组装、功能行使中发挥重要作用.P-小体作为细胞质内m RNA的储存和降解结构在基因表达的转录后调控中起重要作用,其调控机制尚待进一步研究补充,P-小体与小RNA分子(micro RNA,mi RNA)调控的基因沉默之间也存在关联性.